用骨肉瘤衍生细胞外囊泡处理的美相干细胞中的LINE-1甲基化分析

DNA甲基化是发生在人类细胞中的一种主要的表观遗传修饰。脱氧核糖核酸甲基化是指甲基组与CpG二核苷酸中细胞氨酸残留物的联系。这种核苷酸通常存在于基因¹的5’区域的簇（CpG岛）中。在正常细胞中，大多数的二核苷酸处于非甲基化状态，这允许DNA转录。顺便说一句，许多癌症都与高甲基化CpG岛和转录组沉默²有关，特别是在肿瘤抑制基因中，这反过来又促成了癌症³的各种特征。

另一方面，长穿插的核元素1（LINE-1s或L1s）是重复的、可转位DNA元素，在CpG岛屿通常具有高水平的甲基化。LINE-1的甲基化可防止易位，有助于维持基因组的完整性。在几种类型的癌症中，LINE-1被甲基化，导致活化和随后逆转介导染色体不稳定^4。LINE-1占人类基因组⁵的近17%，其甲基化状态可作为全球基因组甲基化水平⁶的指标。全球LINE-1低甲基化被认为是在细胞过渡到肿瘤表型⁷之前;因此，它有望成为早期癌症发病的潜在标志物。

目前，甲基化分析有几种方法，包括热测序、甲基化特异性PCR、微阵列和染色质免疫沉淀^1。下一代测序的使用也使得有可能纳入全基因组的DNA甲基化检测方法。这些方法中有许多依赖于双硫酸盐处理的DNA，其中未甲基化的细胞氨酸转化为尿素，甲基化的细胞氨酸保持不变。然而，使用双硫酸盐处理的DNA有几个陷阱，如未甲基化的细胞氨酸不完全转化为尿素，有偏颇的序列扩增，和测序错误^8。

在甲基化特异性探针扩增（MSPA）中，由两个寡核苷酸靶向DNA序列的探针靶向DNA序列，该DNA序列含有甲基化敏感限制性酶HhaI⁹的限制性位点（GCGC）。探针杂交为DNA后，每个样本被分成两组。第一组中的探针进行结扎，而第二组中的探针进行结扎，随后在未甲基化CGCG位点进行HhaI介导消化。两组样品然后由PCR放大，产品通过毛细血管电泳分离。未甲基化位点的探针由HhaI消化，在PCR期间不放大，因此没有峰值信号。相比之下，甲基化位点的探针受到保护，防止消化，因此在PCR期间被放大，随后产生峰值信号^10。

与替代方法不同，MSPA 具有几个优点。首先，它需要少量的DNA（50-100 ng），非常适合分析从正式固定石蜡嵌入样品¹⁰的DNA。它不需要双硫酸盐处理的DNA;事实上，它不适合以这种方式修饰的DNA。可以同时分析许多样品，并设计MSPA探针，以便它们同时针对多个基因或序列。此外，探针是特定和敏感的甲基化DNA，因为HhaI限制位点对应于一个典型的CpG岛屿¹⁰序列。

本研究调查了骨肉瘤（OS）衍生的细胞外囊泡（EV）对脂肪组织衍生的中质性干细胞（AT-MSCs;图 1.EV 是纳米级、膜结合的囊泡，由大多数细胞类型分泌。它们携带蛋白质、脂质、mRNA、微RNA和来自母细胞^11、12的其他分子。EV调解细胞间通信，并在几种病理生理条件下发挥重要作用^13，14。最近的一项研究显示，癌症衍生的EV可能将活性LINE-1转移到受体细胞^15。此前有报道称，除了其他遗传效应¹⁶外，来自HOS-143B细胞系的EV可以改变MSCs中LINE-1的甲基化状态。

当为EV分离而生长细胞时，在生长培养基中使用EV耗尽的胎儿牛血清[FBS]很重要，因为FBS衍生的EV可能会干扰来自其他来源的EV，并妨碍结果^17，18。超中心化是消耗 FBS EV 的最常见方法之一。与超滤和商业EV耗尽FBS¹⁹等替代品相比，这是一个相对简单和具有成本效益的程序。在这里，该协议还演示了如何通过超离心来制备EV耗尽的FBS。

本文为上述技术提供了详细的协议，从从OS细胞系分离EV到在OSEV处理MSC中的LINE-1甲基化分析（图1）。