ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma

La metilación del ADN es una modificación epigenética importante que se produce en las células humanas. La metilación del ADN se refiere a la vinculación de los grupos metilo con los residuos de citosina en los dinucleótidos de CpG. Estos dinucleótidos se encuentran generalmente en grupos (islas CpG) en la región de 5′ de genes¹. En las células normales, la mayoría de estos dinucleótidos existen en un estado no metilado, lo que permite la transcripción del ADN. Por cierto, muchos cánceres se asocian con islas de CpG hipermetiladas y silenciamiento transcriptomo^2,especialmente en genes supresores de tumores, que a su vez contribuyen a varias señas de identidad del cáncer^3.

Por otro lado, los elementos nucleares intercalados largos-1 (LINE-1s o L1s) son elementos de ADN repetitivos y transposibles que normalmente tienen altos niveles de metilación en las islas CpG. La metilación de LINE-1 previene la translocación y ayuda a mantener la integridad del genoma. En varios tipos de cáncer, LINE-1 se hipotila, lo que resulta en activación y posterior inestabilidad cromosómica mediada por retroposición⁴. LINE-1 representa casi el 17% del genoma humano⁵, y su estado de metilación puede servir como un indicador de los niveles globales de metilación genómica⁶. Se considera que la hipometilación global de LINE-1 precede a la transición de las células a un fenotipo tumoral^7; por lo tanto, es prometedor como un marcador potencial para el inicio temprano del cáncer.

Actualmente, existen varios métodos para el análisis de metilación, incluyendo pirosequencing, PCR específico de metilación, microarrays e inmunoprecipitación de cromatina¹. El uso de la secuenciación de próxima generación también ha hecho posible incorporar enfoques para todo el genoma para la detección de la metilación del ADN. Muchos de estos métodos se basan en ADN tratado con bisulfito, en el que las citosinas no metiladas se convierten en uracilo y las citosinas metiladas permanecen sin cambios. Sin embargo, trabajar con ADN tratado con bisulfito tiene varios escollos, como conversiones incompletas de citosinas no metiladas en uracilo, amplificación sesgada de secuencias y errores de secuenciación^8.

En la amplificación de sonda específica de metilación (MSPA), las sondas compuestas por dos oligonucleótidos se dirigen a secuencias de ADN que contienen un sitio de restricción (GCGC) para la enzima de restricción sensible a la metilación HhaI⁹. Después de que las sondas se hibridan al ADN, cada muestra se divide en dos conjuntos. Las sondas del primer conjunto sufren ligadura, mientras que las sondas del segundo conjunto sufren ligadura seguida de digestión mediada por HhaI en sitios de CGCG no metilados. Ambos conjuntos de muestras son amplificados por PCR, y los productos están separados por electroforesis capilar. Las sondas en sitios no metilados son digeridas por HhaI y no se amplifican durante la PCR, lo que resulta en señales máximas. Por el contrario, las sondas en sitios metilados están protegidas de la digestión y, por lo tanto, se amplifican durante la PCR, generando posteriormente señales máximas^10.

MSPA tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos. En primer lugar, requiere una cantidad baja de ADN (50-100 ng) y es adecuado para el análisis de ADN a partir de muestras incrustadas de parafina fija de formalina¹⁰. No requiere ADN tratado con bisulfito; de hecho, no es adecuado para el ADN que se modifica de esta manera. Muchas muestras se pueden analizar al mismo tiempo, y las sondas MSPA se pueden diseñar de manera que se dirijan a múltiples genes o secuencias simultáneamente. Además, las sondas son específicas y sensibles para el ADN metilado, ya que el sitio de restricción HhaI corresponde a una secuencia típica de las islas CpG^10.

Este estudio investigó los efectos de las vesículas extracelulares derivadas del osteosarcoma (OS) en la metilación LINE-1 en células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AT-MSCs; Figura 1). Los vehículos eléctricos son vesículas a nanoescala unidas a membranas secretadas por la mayoría de los tipos de células. Llevan proteínas, lípidos, ARNm, microARN y moléculas adicionales de las células madre^11,12. Los vehículos eléctricos median la comunicación intercelular y desempeñan un papel importante en varias condiciones fisiopatológicas^13,14. Un estudio reciente mostró que los vehículos eléctricos derivados del cáncer pueden transferir LINE-1 activo a las células receptoras^15. Se ha informado anteriormente que los vehículos eléctricos de la línea celular HOS-143B pueden alterar el estado de metilación de LINE-1 en los MSC, además de otros efectos genéticos¹⁶.

Al cultivar células para el aislamiento de EV, es importante utilizar suero bovino fetal agotado por EV [FBS] en el medio de crecimiento, ya que los vehículos eléctricos derivados del FBS pueden interferir con los vehículos eléctricos de otras fuentes y obstaculizar los resultados^17,18. La ultracentrifugación es uno de los métodos más comunes para agotar los vehículos eléctricos de FBS. Es un procedimiento relativamente simple y rentable en comparación con alternativas como la ultrafiltración y el FBS¹⁹comercial, agotado por EV. Aquí, el protocolo también demuestra cómo preparar FBS agotado por EV por ultracentrifugación.

Este artículo presenta un protocolo detallado para las técnicas antes mencionadas, desde el aislamiento de los vehículos eléctricos de una línea celular del sistema operativo hasta el análisis de metilación de LINE-1 en los MSC tratados con OS-EV(Figura 1).