Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

A metilação de DNA é uma grande modificação epigenética que ocorre em células humanas. A metilação de DNA refere-se à ligação de grupos de metila a resíduos de citosina em dinucleotídeos cpg. Tais dinucleotídeos são geralmente encontrados em aglomerados (ilhas CpG) na região de 5′ genes¹. Em células normais, a maioria desses dinucleotídeos existem em um estado não metilado, o que permite a transcrição do DNA. Aliás, muitos cânceres estão associados a ilhas cpg hipermetiladas e silenciamento transcrita², especialmente em genes supressores tumorais, que por sua vez contribuem para várias marcas do câncer³.

Por outro lado, elementos nucleares longos intercalados-1 (LINE-1 s ou L1s) são elementos repetitivos e transposáveis de DNA que normalmente têm altos níveis de metilação nas ilhas CpG. A metilação da LINHA-1 previne a translocação e ajuda a manter a integridade do genoma. Em vários tipos de câncer, a LINE-1 é hipometificada, resultando em ativação e subsequente instabilidade cromossômica mediada pela retrotransposição⁴. A LINHA-1 é responsável por quase 17% do genoma humano^5,e seu status de metilação pode servir como um indicador dos níveis globais de metilação genômica⁶. A hipometração global line-1 é considerada para preceder a transição das células para um fenótipo tumoral⁷; portanto, mantém a promessa como um marcador potencial para o início precoce do câncer.

Atualmente, existem vários métodos para análise de metilação, incluindo pirosequenciamento, PCR específico de metilação, micromatrizes e imunoprecipitação de cromatina¹. O uso do sequenciamento de próxima geração também possibilitou incorporar abordagens em todo o genoma à detecção da metilação do DNA. Muitos desses métodos dependem de DNA tratado com bisulfite, no qual citosinas não metiladas são convertidas em citosinas uracil e metiladas permanecem inalteradas. No entanto, trabalhar com DNA tratado com bisulfite tem várias armadilhas, como conversões incompletas de citosinas não metiladas ao uracil, amplificação tendenciosa de sequências e erros de sequenciamento⁸.

Na amplificação de sondaespecífica de metilação (MSPA), sondas compostas por duas oligonucleotídeas têm como alvo sequências de DNA contendo um local de restrição (GCGC) para a enzima de restrição sensível à metilação HhaI⁹. Após as sondas hibridizarem para o DNA, cada amostra é dividida em dois conjuntos. Sondas no primeiro set passam por ligação, enquanto as sondas no segundo set passam por ligação seguidas por hhaI mediada digestão em sites CGCG não metilados. Ambos os conjuntos de amostras são então amplificados pelo PCR, e os produtos são separados por eletroforese capilar. Sondas em locais não metilados são digeridas por HhaI e não são amplificadas durante o PCR, resultando em sinais de pico. Em contrapartida, as sondas em locais metilados são protegidas da digestão e, portanto, são amplificadas durante o PCR, gerando posteriormente sinais de pico¹⁰.

O MSPA tem várias vantagens em relação a métodos alternativos. Primeiro, requer uma baixa quantidade de DNA (50-100 ng) e é adequado para análise de DNA de amostras incorporadas de parafina fixa^{fixa 10}. Não requer DNA tratado com bisulfite; na verdade, é inadequado para DNA que é modificado desta forma. Muitas amostras podem ser analisadas ao mesmo tempo, e as sondas MSPA podem ser projetadas de tal forma que visam vários genes ou sequências simultaneamente. Além disso, as sondas são específicas e sensíveis para dna metilado, pois o local de restrição HhaI corresponde a uma sequência típica das ilhas CpG¹⁰.

Este estudo investigou os efeitos das vesículas extracelulares derivadas do osteossarcoma (OS) na metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimal derivadas de tecido adiposo (AT-MSCs; Figura 1). Os EVs são nanoescala, vesículas ligadas à membrana secretadas pela maioria dos tipos de células. Eles carregam proteínas, lipídios, mRNA, microRNA e moléculas adicionais das células-mãe^11,12. Os EVs mediam a comunicação intercelular e desempenham papéis importantes em várias condições patosfisias^13,14. Um estudo recente mostrou que os EVs derivados do câncer podem transferir o LINE-1 ativo para células receptoras¹⁵. Foi relatado anteriormente que os EVs da linha celular HOS-143B podem alterar o estado de metilação da LINHA-1 em MSCs, além de outros efeitos genéticos¹⁶.

Ao cultivar células para isolamento ev, é importante usar o soro bovino fetal esgotado por EV [FBS] no meio de crescimento, uma vez que os EVs derivados do FBS podem interferir com EVs de outras fontes e dificultar os resultados^17,18. Ultracentrifugação é um dos métodos mais comuns para esgotar EVs da FBS. É um procedimento relativamente simples e econômico em comparação com alternativas como ultrafiltração e FBS¹⁹emesquetes comerciais de EV . Aqui, o protocolo também demonstra como preparar o FBS esgotado por EV por ultracentrifugação.

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para as técnicas acima mencionadas, desde o isolamento de EVs de uma linha de células OS até a análise de metilação da LINHA-1 em MSCs tratados com OS-EV(Figura 1).