LINE-1 Methylierungsanalyse in mesenchymalen Stammzellen, die mit Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden

DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Modifikation, die in menschlichen Zellen auftritt. DNA-Methylierung bezieht sich auf die Verknüpfung von Methylgruppen mit Zytosinrückständen in CpG-Dinukleotiden. Solche Dinukleotide finden sich in der Regel in Clustern (CpG-Inseln) in der 5′ Region der Gene¹. In normalen Zellen existieren die meisten dieser Dinukleotide in einem unmethylierten Zustand, der eine DNA-Transkription ermöglicht. Übrigens sind viele Krebsarten mit hypermethylierten CpG-Inseln und transkriptomischer Silencing²verbunden, insbesondere in Tumorsuppressor-Genen, die wiederum zu verschiedenen Merkmalen von Krebs beitragen³.

Andererseits sind lange durchsetzte Kernelemente-1 (LINE-1s oder L1s) repetitive, transponierbare DNA-Elemente, die normalerweise einen hohen Methylierungsgrad auf CpG-Inseln aufweisen. Die Methylierung von LINE-1 verhindert die Translokation und trägt zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität bei. Bei mehreren Krebsarten wird LINE-1 hypomethyliert, was zu einer Aktivierung und anschließender retrotranspositionierter chromosomaler Instabilität⁴führt. LINE-1 macht fast 17% des menschlichen Genoms⁵aus, und sein Methylierungsstatus kann als Indikator für die globale genomische Methylierung⁶dienen. Globale LINE-1-Hypomethylierung gilt als vor dem Übergang von Zellen zu einem Tumor-Phänotyp⁷; daher verspricht sie als potenzieller Marker für den frühen Krebsbeginn.

Derzeit gibt es mehrere Methoden für die Methylierungsanalyse, einschließlich Pyrosequencing, methylierungsspezifischer PCR, Mikroarrays und Chromatin-Immunpräzipitation¹. Die Verwendung der Sequenzierung der nächsten Generation hat es auch ermöglicht, genomweite Ansätze zum Nachweis der DNA-Methylierung zu integrieren. Viele dieser Methoden basieren auf bisulfitbehandelter DNA, bei der unmethylierte Zytosine in Uracil umgewandelt werden und methylierte Zytosine unverändert bleiben. Die Arbeit mit bisulfitbehandelter DNA hat jedoch mehrere Fallstricke, wie unvollständige Umwandlungen von nicht methylierten Zytosinen in Uracil, voreingenommene Amplifikation von Sequenzen und Sequenzierungsfehler⁸.

Bei der methylierungsspezifischen Sondenverstärkung (MSPA) zielen Sonden aus zwei Oligonukleotiden auf DNA-Sequenzen ab, die eine Restriktionsstelle (GCGC) für das methylierungsempfindliche Restriktionsenzym HhaI⁹enthalten. Nachdem die Sonden mit der DNA hybridisiert wurden, wird jede Probe in zwei Sätze unterteilt. Sonden im ersten Satz werden einer Ligation unterzogen, während Sonden im zweiten Satz einer Ligation unterzogen werden, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung an unmethylierten CGCG-Standorten. Beide Probensätze werden dann durch PCR verstärkt, und die Produkte werden durch Kapillarelektrophorese getrennt. Sonden an unmethylierten Standorten werden von HhaI verdaut und während der PCR nicht verstärkt, was zu keinen Spitzensignalen führt. Im Gegensatz dazu sind Sonden an methylierten Standorten vor der Verdauung geschützt und werden daher während der PCR verstärkt, wodurch anschließend Spitzensignale¹⁰erzeugt werden.

MSPA hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Erstens benötigt es eine geringe Menge an DNA (50–100 ng) und eignet sich gut für die Analyse der DNA aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Proben¹⁰. Es erfordert keine Bisulfit-behandelte DNA; in der Tat, es ist ungeeignet für DNA, die auf diese Weise modifiziert wird. Viele Proben können gleichzeitig analysiert werden, und MSPA-Sonden können so konzipiert werden, dass sie mehrere Gene oder Sequenzen gleichzeitig zielen. Darüber hinaus sind die Sonden spezifisch und empfindlich für methylierte DNA, da die HhaI Restriktionsstelle einer Sequenz entspricht, die typisch für CpG-Inseln¹⁰ist.

Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von Osteosarkom (OS)-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf die LINE-1-Methylierung in fettgewebeabgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (AT-MSCs; Abbildung 1). Elektrofahrzeuge sind nanoskalige, membrangebundene Vesikel, die von den meisten Zelltypen abgesondert werden. Sie tragen Proteine, Lipide, mRNA, microRNA und zusätzliche Moleküle aus den Elternzellen^11,12. EVs vermitteln interzelluläre Kommunikation und spielen eine wichtige Rolle bei mehreren pathophysiologischen Bedingungen^13,14. Eine aktuelle Studie zeigte, dass krebsverlesene Elektrofahrzeuge aktive S.1-V1 auf Empfängerzellen übertragen können¹⁵. Es wurde bereits berichtet, dass Elektrofahrzeuge aus der HOS-143B-Zelllinie den Methylierungsstatus von LINE-1 in MSCs verändern können, zusätzlich zu anderen genetischen Effekten¹⁶.

Beim Anbau von Zellen zur EV-Isolierung ist es wichtig, EV-dezimiertes fetales Rinderserum [FBS] im Wachstumsmedium zu verwenden, da FBS-abgeleitete Elektrofahrzeuge EVs aus anderen Quellen stören und die Ergebnisse^17,18behindern können. Ultrazentrifugation ist eine der häufigsten Methoden zur Erschöpfung von Elektrofahrzeugen von FBS. Es ist ein relativ einfaches und kostengünstiges Verfahren im Vergleich zu Alternativen wieUltrafiltration und kommerzielle EV-erschöpftfb19 . Hier zeigt das Protokoll auch, wie EV-erschöpfte FBS durch Ultrazentrifugation vorbereitet werden.

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die oben genannten Techniken vor, von der Isolierung von Elektrofahrzeugen von einer OS-Zelllinie bis zur Methylierungsanalyse von LINE-1 in OS-EV behandelten MSCs (Abbildung 1).