我々は、マウス脳ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示する。抗生物質フリー濃縮指向のペリサイト抽出に基づいて、このプロトコルは、高純度と高収率を提供するインビトロ研究のための貴重なツールであり、したがって、使用される実験動物の数を減少させる。
近年、脳ペリサイトは血管生物学や病理学の広範な研究の焦点となっています。血液脳関門形成と生理学におけるペリサイトの重要性は現在実証されているが、その分子基盤はほとんど未知のままである。神経疾患における脳ペリサイトの病態生理学的役割は興味深く、非常に重要であるため、in vitroモデルは十分に適切であるだけでなく、これらの研究のために異なる技術を組み込むことができる。脳ペリサイトの抽出のためのin vitroモデルとしていくつかの方法が提案されているが、高出力の抗生物質フリープロトコルが望ましい。最も重要なことは、抽出あたりの出力を増加させる方法は、より多くの動物の使用量を減らす。
ここでは、十分に高い出力で脳ペリサイトを抽出するための簡単かつ効率的な方法を提案する。マウス脳組織ホモジネートは、組織破片と微小血管ペレットの分離のためのBSA-デキストラン溶液と混合される。3段階の分離を提案し、続いて濾過を行い、マイクロ容器に豊富な濾液を得る。この方法により、10匹のマウスから得られる微小血管断片の量は、6ウェルプレートの種子9ウェル(それぞれ9.6cm2)に十分である。最も興味深いことに、このプロトコルを使用すると、ユーザは通路2で27ペリサイトリッチウェル(それぞれ9.6cm2)を得ることができます。ペリサイト培養物の純度は、古典的なペリサイトマーカーの発現によって確認される:NG2、PDGFR-βおよびCD146。この方法は、ペリサイトに関する生理学的および病態生理学的研究のための効率的かつ実現可能なin vitroツールを示す。
脳ペリサイトは、血液脳関門(BBB)、グリア細胞、細胞外マトリックスおよびニューロンの脳内皮細胞を有する機能単位を含む神経血管ユニット(NVU)の必須成分である。ペリサイトは、分子および細胞情報の交換のためのインターフェースの1つとして機能する中枢神経系(CNS)の調節された機能に不可欠な部分です。
脳のペリサイトは、脳マイクロ血管のアブラル側に埋め込まれており、1を確立し、2 BBB生理学を維持するために不可欠です。いくつかの最近の研究はまた、血管新生3および血管成熟4における脳ペリサイトの役割を強調している、内皮形態形成5および生存6、および脳コレステロール代謝を制御する。重要なことに、これらのプロセスのいずれにおいても調節障害は、神経変性疾患の病因的特徴である。
実際、ペリサイトは、正常なBBB機能といくつかの神経疾患の進行に対するその保護のための機能的な必要性である。変性生理学およびペリサイトの喪失は、アルツハイマー病8の進行における共通分母であり、白質機能障害9時の神経喪失、多発性硬化症10、敗血症性脳症11、急性期虚血性脳卒中12および他の神経疾患における。ペリサイトはまた、腫瘍転移13に役立つ。興味深いことに、ペリサイトはまた、神経学的外傷および障害の後に救助の役割を示すことが示されている:脳1のレミエリ化において、虚血性脳卒中、脊髄損傷14および血管新生を促進する。神経学的外傷および障害の病態生理学的症状を補強するペリサイトの感受性は、それら潜在的な治療標的16となる。
BBBのペリサイトのインビトロ研究モデルは、広範な研究を行うための重要なツールです。これらのモデルはBBBのより働くモデルを表すことによってより精巧な研究のためのプラットホームを提供する。例えば、これらのモデルは、ペリサイト内およびNVUの他の細胞型の間で細胞生理学を理解するために使用することができる。また、in vitroモデルは、新薬や分子がペリサイトに及ぼす薬理学的影響をテストするための直接的な調査ツールです。これらのモデルはまた、神経疾患に関連するペリサイトの病態生理学的役割を理解するために使用することができる。それにもかかわらず、in vitroモデルの開発は、実験的な自由を可能にするために出力を増加する必要があります。これらのモデルは、簡単かつ迅速であり、使用される実験動物の数を減らす必要があります。さらに、このようなモデルを二重および三重細胞培養モデルに開発する能力が望ましい。
開発されたプロトコルは数多くあります。Tigges et al.17,Chen et al.18,Thomsen et al.19,Yamazaki et al.20, クラウチとドエッチ21によって提案されたプロトコルは、ほとんどの必需品を満たす称賛すべきアプローチである。これらの方法はすべて効果的な結果をもたらすが、多数の実験動物への依存は、これらのプロトコルの共通分母のままである。そのため、ペリサイトを最大限の効率で単離・精製できる高出力法の開発が必須となる。このプロトコルでは、第2の通路の後に得られた細胞の純度が、いくつかのペリサイトマーカーで検証される。ペリサイト17の古典的マーカーとして用いられている血小板由来成長因子受容体β(PDGFR-β)と、ペリサイト媒介血管形態形成22及び血管化23のマーカーであるNG2(ニューロングリア抗原2)について確認した。また、ペリサイト17、18で発現する分子の1つとして報告されている分化146(CD146)のクラスターについても確認した。
ここでは、マウス(野生型またはトランスジェニック)からの一次ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示し、前述のすべての要件を高出力で満たす。原発性脳ペリサイトに対して抗生物質および免疫配管遊離選択ベースの増殖方法を採用し、インビトロ研究を行うための効率的なモデルとなる。
脳のペリサイトは、NVUの不可欠な部分であり、BBB24の誘導および維持に積極的な役割を果たしている。同様に、異なる神経変性疾患および血管病理におけるこれらの細胞の役割は興味深い。したがって、効率的な高出力プライマリペリサイト細胞モデルは、インビトロ研究のための効率的なプラットフォームを提供します。
原発性ペリサイトの単離のために提案されている様々なプロトコルがあります(図4)。Tigges et al.17は髄質を有する皮質組織を含む方法を示唆した。このアプローチは、6匹のマウス(パパイン/DNase酵素による37°、70分の消化)からの組織の圧入、続いて21Gおよび18G針を介した崩壊ステップである。このプロトコルは、少なくとも2つのコラーゲンIが6ウェルプレートのウェルをコーティングした1ステップ分離(22%BSA/PBS溶液中の遠心分離)を示唆している。細胞は、ペリサイト増殖を促進するために通過細胞のためのペリサイト増殖培地(PGM)の3以降の通過まで内皮細胞増殖培地(ECGM)に維持される。別の同様のアプローチでは、Chen et al.18は、37°Cで90分間コラゲナーゼ/DNaseで組織を殺菌カミソリブレードと組織消化でダイシングすることにより組織解離を提案した。細胞のワンステップ分離(22%BSAで遠心分離)に続いて、ミエリン層を除去し、ペレットをECGMで2回洗浄する。マイクロ容器は、6ウェルプレートをコーティングしたコラーゲン3ウェルにめっきされています。合流に達した後、細胞は2回通過し、後にPGMで維持される。結局、細胞が3の比率で渡された場合、プロトコルの開始時に10匹のマウスを使用した場合にのみ、6ウェルプレートの27ウェルを得ることができます。
Thomsenらにおいて、著者らは2段階酵素消化19を介して脳ペリサイトの単離を示唆している。髄細か月と白物を取り除き、脳のサンプルを小さく切る。組織片は、20%BSAで分離の1ステップに続いて、37°Cで75分間コラゲナーゼ/DNase Iで最初の酵素反応を受ける。ペレットを回収し、37°Cで50分間コラゲナーゼ/ディスパーゼ/DNase Iでさらに消化する。このステップの後に、33%パーコール勾配でマイクロ容器分離が行われ、さらに一度洗浄される。マイクロ容器は、コラーゲンIV/フィブロネクチンコーティングされた35ミリメートルの皿に播種されています。ペリサイトの増殖は、10日間DMEMにおいて10%FCSおよび硫酸ゲンタマイシンによって支持される。別の2段階酵素消化アプローチでは、山崎らから、低温DMEM20における切除組織のミンチを示唆する。最初の酵素反応では、サンプルをコラゲナーゼ/DNase Iで37°Cで75分間処理する。1段階遠心分離の後、ペレットは再び一度洗浄され、2番目の酵素反応は37°Cで60分間コラゲナーゼ/ディスパスで開始される。ワンステップ分離の後、ペレットを再懸濁し、22%BSA溶液で遠心分離する。最後に、微小血管ペレットを再懸濁し、6ウェルプレートにめっきする。5つのマウス脳の場合、6ウェルプレートの1ウェルをめっきすることができます。ペリサイトを得るために、内皮培養物は、マウス脳内皮細胞(mBEC)培地IIに維持されながら、スライスを通過させられる。クラウチおよびドエッチ20は、FACSによるペリサイト精製法を示唆する。マウス脳の皮質および心室-心室-心室-心室-心室領域からの組織サンプルは、微小解剖され、メスで十分に細かくミンチされる。コラゲナーゼ/ディスパーゼ酵素インキュベーションを37°Cで30分間インキュベートした後、消化された組織をミエリンから分離し、22%v/vパーコール溶液で遠心分離した破片。細胞懸濁液は、FACS分析および選別のために蛍光結合抗体でインキュベートされる。選別された細胞は、24ウェルプレートのコラーゲンコーティングされたウェルでめっきされる。1つの皮質は、24ウェルプレートの1ウェルで1つのめっきに十分な細胞を生み出すことを示唆している。
たとえ生産的であっても、これらの方法には、単一のバッチ分離のための動物の数が多い場合から、非常に限られた量の出力まで、いくつかの制限が伴います。
この提案されたプロトコルの開発中に、我々は高出力を得することに成功しました:わずか10匹のマウスから6ウェルプレートの9ウェル。この端に、髄腔の除去は組織からの大きな血管の1段階の除去を保障する。Dounce組織グラインダーは、脳などの軟組織に適しています。また、緩い害虫によるサンプル還元、タイトな害虫との均質化を保証し、不必要な細胞損傷を防ぎます。一次細胞培養プロトコルの主な目的の1つは、組織の最小限の無駄と脳血管系の拡張検索です。提示されたプロトコルでは、これはデキストランBSA注入組織ホモジネートの反復遠心分離によって達成される。3段階の遠心分離アプローチは、組織ホモジネートから大量の血管系を回収するのに役立ちます。これはマイクロ容器の3倍の高められた回復を提供する。分離後、濾過は、平滑筋細胞関連大血管の排除を支持する次の重要なステップです。前に述べたように、酵素消化のために異なる酵素の組み合わせが提案されている。DNaseとコラゲナーゼ/ディスアーゼは、細胞の塊を減らし、単一細胞をそれぞれ単一の細胞を分離するために使用されますが、このような侵襲的な環境で細胞死を防ぐことが非常に重要であり、それによって最終的な収率が増加するTLCKによって防止されます。最初は、最初の通路は内皮単層を成長させ、後に単層上の付着したペリサイトの増殖を支持する。一次内皮細胞の生存率は通過時に減少するため、ペリサイト検索の確率を高める。さらに、このプロトコルは内皮細胞汚染の回避を保障する別のパセリジングを採用する。なお、P2からの細胞数が多いほど、細胞のさらなる通過への依存性が低下する。さらに、平滑筋細胞によってペリサイトの増殖が追い越される可能性を減らし、はるかに高い速度で増殖する。
より高い出力を達成するためには、温度と時間に関して重要かつ正確に実行する必要があるいくつかのステップがあります。BSA-デキストランにホモジネートした組織の混合は速いはずです。遠心分離ステップ後のペレット解離は、細胞死を防ぐために迅速であるべきです。さらに、酵素消化の33分は精密と注意を払って行われるべきである。このプロトコルの制限の1つは、内皮単層が成長し、ペリサイトの成長をさらに促進することが許される7〜8日間の持続時間である。明らかに、マイクロ血管の単離はbtterであり、単層の成長はより速く、したがってペリサイトの数が増加する。ペリサイトの増殖をさらにサポートするのに十分な数の微小血管分率を確保するために、各抽出で10未満のマウスを使用しないことをお勧めします。前述の点を注意深く従えば、脳ペリサイト培養に所望の細胞密度を容易に達成することができる。
in vitroモデルは、神経疾患中のNVUの他の細胞間の病態生理学的関連性およびコミュニケーションに関するより多くの情報を得るために誘導体モデルの開発のための実行可能なプラットフォームを提供する。単離されたペリサイトは、バイセル細胞培養(内皮またはグリア細胞を有する)および三細胞培養(内皮およびグリア細胞)モデルに組み込むことができる。これらのモデルの開発については、ここでは説明していません。結論として、このプロトコルは、より高い出力を有する一次細胞の単離のための1つのアプローチと、脳ペリサイト生物学に関連する体外研究のためのより良いプラットフォームを提供する。
The authors have nothing to disclose.
LTとFGは、プロジェクトSNOWBALLのためのEU共同プログラム -神経変性疾患研究(JPND)の枠組みの中でアジェンス・ナショナル・デ・ラ・レッチェルシュ(ANR、ANR-15-JPWG-0010)によって付与されました。
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |