We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.
In de afgelopen jaren, cerebrale pericytes zijn uitgegroeid tot de focus van uitgebreid onderzoek in vasculaire biologie en pathologie. Het belang van pericytes in de bloed-hersen barrière vorming en fysiologie wordt nu aangetoond, maar de moleculaire basis blijft grotendeels onbekend. Aangezien de pathofysiologische rol van cerebrale pericytes aan neurologische aandoeningen intrigerend is en van groot belang, zijn de in vitro modellen niet alleen voldoende geschikt maar ook in staat om verschillende technieken voor deze onderzoeken op te nemen. Verschillende methoden zijn voorgesteld als in vitro modellen voor de extractie van cerebrale pericytes, hoewel een antibioticum-vrij protocol met een hoog vermogen wenselijk is. Het allerbelangrijkste is dat een methode met een toegenomen output per extractie het gebruik van meer dieren vermindert.
Hier, wij stellen voor een eenvoudige en efficiënte methode voor het extraheren van cerebrale pericytes met voldoende hoge output. Het muis hersenweefsel homogeniëren wordt gemengd met een BSA-dextran-oplossing voor de scheiding van het weefsel puin en de microvasculaire pellet. We stellen een scheiding van drie stappen voor, gevolgd door filtratie om een permeabiliteit rijk filtraat te verkrijgen. Bij deze methode is de hoeveelheid microvasculaire fragmenten verkregen uit 10 muizen voldoende om 9 putjes (9,6 cm2 elk) van een 6-Wells plaat te zaaien. Het meest interessant met dit protocol, de gebruiker kan verkrijgen 27 pericyte Rich Wells (9,6 cm2 elk) in passage 2. De zuiverheid van de pericyte culturen wordt bevestigd met de uitdrukking van klassieke pericyte markers: NG2, PDGFR-β en CD146. Deze methode demonstreert een efficiënte en haalbare in-vitro tool voor fysiologische en pathofysiologisch onderzoek op pericytes.
Cerebrale pericytes zijn een essentieel onderdeel van de neurovasculaire eenheid (NVU), die bestaat uit een functionele eenheid met de cerebrale endotheliale cellen van de bloed-hersen barrière (BBB), gliacellen, extracellulaire matrix en neuronen. Pericytes zijn een essentieel onderdeel van de gereguleerde werking van het centrale zenuwstelsel (CNS), omdat ze fungeren als een van de interfaces voor de uitwisseling van moleculaire en cellulaire informatie.
Cerebrale pericytes zijn ingebed in de abluminale kant van de micro vaten van de hersenen, en zijn essentieel voor het vestigen van1 en het handhaven van2 de BBB fysiologie. Verschillende recente werken hebben ook de rol van cerebrale pericytes in angiogenese3 en het vat maturatie4, endotheliale morphogenesis5 en Survival6benadrukt, en bij het beheersen van de hersenen cholesterol metabolisme7. Belangrijk, de disregulatie in een van deze processen zijn etiologische kenmerken van neurodegeneratieve ziekten.
Inderdaad, pericytes is een functionele noodzaak voor normale BBB-werking en de bescherming tegen de progressie van verschillende neurologische aandoeningen. Degenererende fysiologie en verlies van pericytes zijn gemeenschappelijke noemers in de progressie van de ziekte van Alzheimer8, neuronale verlies tijdens witte stof dysfunctie9, multiple sclerose10, septische encefalopathie11, acute fase ischemische beroerte12 en in andere neurologische aandoeningen. Pericytes zijn ook instrumentaal in tumor metastasen13. Belangwekkend, pericytes is ook aangetoond dat het vertonen van een reddings functie na neurologische trauma en aandoeningen: in remyelinisatie in hersenen1, ischemische beroerte, ruggenmergletsel14 en bevordering van angiogenese15. De gevoeligheid van pericytes ter versterking van de pathofysiologische manifestatie van neurologische trauma en aandoeningen maakt hen een potentieel therapeutisch doel16.
In vitro onderzoek modellen van pericytes in de BBB zijn belangrijke instrumenten om uitgebreide studies uit te voeren. Deze modellen bieden een platform voor meer uitgebreide studies door het vertegenwoordigen van Werkmodellen van de BBB en meer. Deze modellen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om de cellulaire fysiologie binnen pericytes en onder andere celtypen van de NVU te begrijpen. Ook, in vitro modellen zijn uit de eerste hand onderzoek tools voor het testen van de farmacologische invloed van nieuwe drugs en moleculen op pericytes. Deze modellen kunnen ook worden gebruikt om te begrijpen van de pathofysiologische rol van pericytes in verband met neurologische aandoeningen. Niettemin, de ontwikkeling van in vitro modellen vereist een verhoogde output om experimentele vrijheid mogelijk te maken. Deze modellen moeten gemakkelijk en snel zijn en het aantal gebruikte proefdieren verminderen. Bovendien is de mogelijkheid om dergelijke modellen te ontwikkelen tot een dubbele en drievoudige celkweek modellen wenselijk.
Er zijn veel protocollen die zijn ontwikkeld. De protocollen die door Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20en Crouch en DOETSCH21 zijn voorgesteld, zijn prijzenswaardige benaderingen die voldoen aan de meeste benodigdheden. Al deze methoden opleveren effectieve resultaten, maar de afhankelijkheid van een groot aantal proefdieren blijft een gemeenschappelijke noemer voor deze protocollen. Daarom wordt het verplicht om een hoge uitgangs methode te ontwikkelen die pericytes met maximaal mogelijke efficiëntie kan isoleren en zuiveren. In dit protocol wordt de zuiverheid van de cellen die na een tweede passage zijn verkregen, geverifieerd met verschillende pericytes markers. We checkten op bloedplaatjes-afgeleide groei factor receptor-β (PDGFR-β), die wordt gebruikt als een klassieke marker van pericytes17, en voor ng2 (neuron-glial antigeen 2), wat is een marker van pericyte gemedieerde vasculaire morphogenesis22 en vascularisatie23. We hebben ook gecontroleerd op cluster van differentiatie 146 (cd 146), dat is gerapporteerd als een van de moleculen uitgedrukt in de pericytes17,18.
Hier presenteren we een protocol voor de extractie van primaire pericytes aan muizen (wild type of transgenics) dat voldoet aan alle bovengenoemde eisen met een hoog vermogen. We hanteren een antibioticum en immunopanning Vrije selectie-gebaseerde methode van proliferatie voor de primaire cerebrale pericytes, die zichzelf een efficiënt model zal bewijzen voor het uitvoeren van in vitro studies.
Cerebrale pericytes zijn een integraal onderdeel van de NVU en spelen een actieve rol bij de inductie en het onderhoud van de BBB24. Evenzo is de rol van deze cellen in de verschillende neurodegeneratieve aandoeningen en vasculaire pathologieën intrigerend. Vandaar dat een efficiënt hoog uitgangs primair pericyte celmodel een efficiënt platform biedt voor in vitro studies.
Er zijn verschillende protocollen die zijn voorgesteld voor de isolatie van primaire pericytes (Figuur 4). Tigges et al.17 stelde een methode voor met inbegrip van corticale weefsel met hersenvliezen. Deze aanpak is de maling van weefsel van 6 muizen (een 37 ° c, 70 min spijsvertering met papain/DNase enzymen) gevolgd door een desintegratie stap via 21 G en 18 G naalden. Dit protocol suggereert een scheiding van één stap (centrifugeren in 22% BSA/PBS-oplossing) die ten minste 2 collageen I gecoate putten van een 6-Wells plaat oplevert. De cellen worden gehandhaafd in endotheliale celgroei medium (ECGM) tot passage 3 en later in pericyte groeimedium (PGM) voor het doorvoeren van cellen om de proliferatie van pericyt te bevorderen. In een andere soortgelijke benadering, Chen et al.18 voorgesteld weefsel dissociatie door het weefsel te dicteren met een gesteriliseerd scheermesje en weefsel spijsvertering met collagenase/DNase voor 90 min bij 37 °c. Na één-stap scheiding (centrifugeren in 22% BSA) van de cellen, wordt de myeline-laag verwijderd en wordt de pellet tweemaal in ECGM gewassen. De micro vaten zijn verguld in 3 putjes van een collageen I gecoat 6-well platen. Na het bereiken van samenvloeiing worden de cellen twee keer door de gang en later onderhouden in PGM. Uiteindelijk, als cellen worden doorgegeven in verhouding van 3, we kunnen verkrijgen 27 putten van 6-Wells platen alleen bij het gebruik van 10 muizen in het begin van het protocol.
In Thomsen et al., de auteurs suggereren isolatie van cerebrale pericytes via een tweestapsenzym vertering19. Hersenvliezen en witte stof worden verwijderd en de hersenen monsters worden in kleine stukjes gesneden. De weefsel stukken ondergaan de eerste enzym reactie in Collagenase/DNase I voor 75 min bij 37 °C, na één stap van afscheiding in 20% BSA. De pellet wordt verzameld en verder verteerd in Collagenase/dispase/DNase I voor 50 min bij 37 °C. Deze stap wordt gevolgd door de scheiding van micro vaten in een 33% Percoll gradiënt en daarna eenmaal gewassen. De micro vaten worden gesekt op collageen IV/fibronectin gecoat 35 mm gerechten. De proliferatie van pericytes wordt begunstigd door 10% FCS en gentamicine sulfaat in DMEM gedurende 10 dagen. In een andere tweestapsenzym verterings benadering suggereren Yamazaki et al. het hakken van het bekraste weefsel in koude DMEM20. In de eerste enzym reactie worden monsters behandeld met collagenase/DNase I voor 75 min bij 37 °C. Na één stap centrifugeren wordt de pellet weer eenmaal gewassen en wordt een tweede enzym reactie gestart in Collagenase/dispase voor 60 min bij 37 °C. Na een scheiding in één stap wordt de pellet geresuspendeerd en gecentrifugeerd in 22% BSA-oplossing. Ten slotte wordt de microvasculaire pellet geresuspendeerd en verguld in een 6-well plaat. Voor 5 muizenhersenen kan 1 put van een 6-well plaat worden verguld. Voor het verkrijgen van de pericytes, endotheelculturen worden doorgangen driemaal terwijl onderhouden in muis hersenen endotheliale cel (mBEC) medium II. Crouch en DOETSCH20 suggereren pericyte zuiveringsmethode door FACS. Weefselmonsters van cortex en ventriculaire – subventriculaire zone van muizenhersenen zijn micro-ontleed en grondig fijngehakt met een scalpel. Na inincubatie van Collagenase/dispase voor 30 minuten bij 37 °C wordt het verteerde weefsel gescheiden van myeline en puin gecentrifugeerd in een 22% v/v Percoll-oplossing. De celsuspensie wordt vervolgens geïnfiltreerd in fluorescently geconjugeerde antilichamen voor FACS analyse en sortering. De gesorteerde cellen worden geplateerd in met collageen gecoate putjes van 24 putplaat. Er wordt gesuggereerd dat een cortex voldoende cellen oplevert voor één plating in 1 put van 24-well plate.
Zelfs als productief, deze methoden worden geleverd met verschillende beperkingen, van het gebruik van een groot aantal dieren voor één batch-isolatie tot een zeer beperkte hoeveelheid uitvoer.
Tijdens de ontwikkeling van dit voorgestelde protocol waren we succesvol in het verkrijgen van een hoog vermogen: 9 putten van een 6-Wells plaat van slechts 10 muizen. Om dit te doen, de verwijdering van hersenvliezen zorgt voor de één stap verwijderen van grote vaten uit het weefsel. De Dounce weefsel slijper is geschikter voor zachte weefsels zoals de hersenen. Het zorgt ook voor monster reductie met de losse stamper, homogenisatie met de strakke stamper, en voorkomt onnodige cellulaire schade. Een van de belangrijkste doelstellingen in de primaire celcultuur protocollen is de minimale verspilling van weefsel en uitgebreide ophalen van cerebrale vasculatuur. In het gepresenteerde protocol wordt dit bereikt door herhaalde centrifugeren van het dextran-BSA-geïnfundeerd weefsel homogenaat. Een driestappen centrifugeren aanpak helpt om grote hoeveelheden vasculatuur uit het weefsel homogenaat. Dit biedt een 3x verbeterd herstel van micro schepen. Na scheiding is filtratie de volgende essentiële stap, die de uitsluiting van de met gladde spiercellen geassocieerde grote schepen bevordert. Zoals eerder vermeld, is een combinatie van verschillende enzymen voorgesteld voor enzymatische spijsvertering. Hoewel DNase en Collagenase/dispase worden gebruikt om er klontjes van cellen te verminderen en afzonderlijke cellen te isoleren, is het erg belangrijk om de celdood in zo’n invasieve omgeving te voorkomen en dit wordt voorkomen door tlck, waardoor het uiteindelijke rendement toeneemt. In eerste instantie is de eerste passage toegestaan om een endotheliale monolayer, die later de groei van bijgevoegde pericytes op de unilayer ondersteunt groeien. Aangezien het voortbestaan van primaire endotheel cellen wordt verminderd bij het doorvoeren, verhoogt het de kans op het ophalen van pericyte. Bovendien maakt dit protocol gebruik van een andere passage die ervoor zorgt dat de besmetting van de endotheel cellen wordt vermeden. Opgemerkt moet worden dat met een hoger aantal cellen van P2, de afhankelijkheid van verdere passage van de cellen wordt verminderd. Bovendien, het vermindert de mogelijkheid van pericyt groei wordt ingehaald door gladde spiercellen, die prolifereren op veel hoger tarief.
Om een hogere output te bereiken, zijn er verschillende stappen die kritisch zijn en nauwkeurig moeten worden uitgevoerd met betrekking tot temperatuur en tijd. Het mengen van weefsel homogenaat in BSA-dextran moet snel zijn. De pellet dissociatie na de centrifugeren stappen moet snel te voorkomen dat de celdood. Bovendien, 33 min van enzymatische spijsvertering moet worden gedaan met precisie en zorg. Een van de beperkingen voor dit protocol is de duur van de 7-8 dag dat endotheliale unilayer mag groeien en verdere vergemakkelijking van de groei van pericytes. Blijkbaar, de isolatie van micro vaten is btter, de groei van unilayer is sneller, en daarom zijn er een toegenomen aantal pericytes. Het wordt aanbevolen om niet minder dan 10 muizen in elke extractie te gebruiken om te zorgen voor een voldoende aantal microvasculaire fracties om de groei van pericyt verder te ondersteunen. Als de bovengenoemde punten zorgvuldig worden opgevolgd, kan de gewenste celdichtheid voor cerebrale pericyt cultuur gemakkelijk worden bereikt.
In vitro modellen bieden een haalbaar platform voor de ontwikkeling van afgeleide modellen om meer informatie te verkrijgen over de pathofysiologische relevantie en de communicatie tussen de andere cellen van de NVU tijdens neurologische aandoeningen. Geïsoleerde pericytes kunnen worden opgenomen in een bi-cellulaire cultuur (met endotheel-of gliacellen) en Tri-cellulaire cultuur (endotheliale en gliale cellen) modellen. De ontwikkeling van deze modellen is hier niet besproken. Tot slot, dit protocol biedt een aanpak voor de isolatie van primaire cellen met een hogere output en een beter platform voor in vitro onderzoek met betrekking tot de cerebrale pericyte biologie.
The authors have nothing to disclose.
LT en FG werden verleend door Agence nationale de la recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) in het kader van het gemeenschappelijk programma van de EU – Neurodegeneratief ziekte onderzoek (JPND) voor project SNOWBALL.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |