Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Directiva Europea 2010/63/UE y fueron aprobados por la Comisión Central Checa de Bienestar Animal. 1. Materiales Animales de la casa en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencias Animales de Laboratorio con acceso gratuito a la comida regular y el agua potable. Animales de la casa bajo un ciclo oscuro/claro de 12 h/12 h. Para el aislamiento y el cultivo de hepatocitos, utilice animales de 8 a 12 semanas de edad. Soluciones de stock A y B Preparar la solución de stock A y la solución de stock B de acuerdo con la Tabla 1 y la Tabla 2,respectivamente, con antelación. Disolver todos los componentes en 1 L de H2O destilado (dH2O). Ajuste el pH de las soluciones a 7,2 y filtre las soluciones a través de un filtro de 0,2 m. Ambas soluciones se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses. Solución de stock C Prepare la solución C el día del aislamiento primario de los hepatocitos. Agregue todos los componentes según la Tabla 3, rellene a un volumen total de 50 ml con dH2O y disuelva. Ajuste el pH a 7.3. Aliquot 50 mL de la solución en tubos de 50 ml. Use un tubo por animal. Coloque todas las alícuotas necesarias en un baño de agua precalentado (37 oC). Solución de stock D Prepare la solución D el día del aislamiento primario de los hepatocitos. Agregue todos los componentes de acuerdo con la Tabla 4,rellene a un volumen total de 30 ml con dH2O y disuelva. Ajuste el pH a 7.3. Aliquot 30 mL de la solución en tubos de 50 ml. Añadir la colagenasa I (5 mg/30 ml) en la solución D. Use una alícuota por animal. Colocar todas las alícuotas en un baño de agua precalentado (37 oC). Solución de stock E Prepare la solución E el día del aislamiento primario de los hepatocitos. Agregue todos los componentes de acuerdo con la Tabla 5, rellene a un volumen total de 50 ml con dH2O y disuelva. Ajuste el pH a 7.3. Aliquot 50 mL de la solución en tubos de 50 ml. Añadir albúmina V (0,65 g/50 ml) en la solución E. Utilice una alícuota por animal. Colocar todas las alícuotas en un baño de agua precalentado (37 oC). 2. Preparación de sándwiches de colágeno Un día antes del aislamiento de hepatocitos primarios, prepare la primera capa del sándwich de colágeno I.NOTA: Trabaje sobre hielo y utilice soluciones preenfriadas, puntas, placas y tubos para minimizar la gelación no deseada de colágeno I. Neutralizar la cantidad requerida de colágeno I (de la cola de rata) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se requiere un volumen de 100 ml de colágeno neutralizado (1,5 mg/ml) por muestra experimental (plato de 3,5 cm). Para preparar 1 ml de colágeno neutralizado (1,5 mg/ml), añadir 100 ml de 10x DMEM, 1,5 ml de NaOH de 1M y 48,5 ml de dH2O en 500 ml de colágeno (concentración de stock de 3 mg/ml). Compruebe el pH del colágeno neutralizado con papel de litmus (el pH debe ser de 7,5). Disperse 100 ml de solución de colágeno neutralizado uniformemente utilizando una punta preenfriada de 200 l sobre la superficie de un plato de 3,5 cm sobre hielo. Incubar durante la noche en condiciones de cultivo estándar (incubadora con 5% deCO2 a 37oC). El día del aislamiento primario de hepatocitos, agregue 1 ml de PBS precalentado (37 oC) a la primera capa de colágeno. Dejar que el colágeno se rehidrate durante 2-3 h a 37oC. 3. Equipamiento configurado Prepare todo el equipo como se indica en la Tabla de materiales y configure como se muestra en la Figura 1. 4. Procedimiento quirúrgico Anestesiar el ratón mediante inyección intramuscular de tetimina (60 mg/kg de peso corporal), zolazepam (60 mg/kg) y xilazina (4,5 mg/kg). Después de varios minutos, confirme la anestesia adecuada por el pellizco del dedo del pie. Si el animal no responde al pellizco, proceda a 4.2. Coloque el ratón anestesiado en una estera de disección y pegue las extremidades inferior y superior para fijar el ratón en una posición supina. Swab el abdomen con 70% de etanol y abrir el abdomen con una incisión en forma de V desde el área púbica hasta las piernas delanteras. Dobla la piel sobre el pecho para descubrir la cavidad abdominal. Coloque la alfombra de disección bajo un microscopio de disección. Doble una aguja de jeringa de insulina (30 G) en un ángulo de 45o. Exponer la vena cava inferior (IVC) moviendo los intestinos y el colon en la dirección caudal. Llene 2,5 ml de solución precalentada (37 oC) en una jeringa de 2 ml con una cánula. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la cánula o jeringa. Antes de la cannulación del CIV, vuelva a colocar los lóbulos hepáticos presionando hasta el diafragma con un hisopo de algodón húmedo (PBS). Coloque una sutura de seda alrededor de la CIV justo debajo del hígado(Figura 2A,B). Inyectar 10 l de heparina (5000 U/ml) en la vena porta utilizando una jeringa de insulina con una aguja de 30 G doblada en un ángulo de 45o(Figura 2C). Para canalizar el hígado, hacer una pequeña incisión con tijeras microquirúrgicas al CIV directamente al lado del hígado (debajo de la sutura; Figura 2D) que es lo suficientemente grande como para insertar la cánula. Fije la cánula en la posición utilizando suturas y dos nudos quirúrgicos(Figura 2E). Cortar la vena portal(Figura 2F) para permitir que los tampones de perfusión fluyan desde el hígado para evitar la expansión del hígado. Permanuale manualmente el hígado con 1,5 ml de solución precalentada C presionando lentamente la jeringa conectada a la cánula (esto debe tomar 15 s). La eliminación de sangre del hígado por decoloración del hígado ahora se puede observar. Prellene una bomba peristáltica con solución precalentada (37 oC) C. Compruebe el aparato de perfusión y asegúrese de que no haya burbujas de aire en el sistema. Desconecte con precaución la cánula de la jeringa y conéctela al tubo de la bomba peristáltica que funciona a un caudal de 2,5 ml/min. Trabaje con rapidez pero con cuidado y asegúrese de que la cánula permanezca en posición y de que no entre burbujas en el tubo o la cánula. Perfumar el hígado con la solución C durante 2 min (5 ml de la solución C). Cambie a la solución D y continúe la perfusión durante 10 min (25 ml de solución D). Una vez que el hígado ha sido perfundido, retírelo de la cavidad abdominal. El hígado ahora será muy frágil y de color pálido(Figura 3). 5. Aislamiento de hepatocitos primarios Retire el hígado del ratón. La cánula todavía estará atada al hígado, así que usa los fórceps para levantar la cánula con el hígado, y cuidadosamente cortar todas las conexiones de fascia. Transfiera el hígado a un tubo de 50 ml que contenga 20 ml de solución Precalentada E. Sostenga la cánula con el hígado usando fórceps y desasocie el tejido frotando el hígado alrededor de la pared del tubo para transferir los hepatocitos aislados al tampón. Mantenga las células aisladas en hielo.NOTA: Los hepatocitos primarios aislados son viables durante varias horas mientras se mantienen en hielo. Los usuarios pueden repetir los pasos 4.1 a 5.2 aisleando los hepatocitos primarios de otro ratón donante, si es necesario, o continuar con el siguiente paso. Coloque un colador de células de nylon de 70 m encima de un tubo de 50 ml y filtre las células aisladas. Centrifugar el tubo a 50 x g y 4 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Para eliminar las células muertas y aumentar el porcentaje de células viables, resuspenda el pellet en 20 ml de 40% percol en DMEM. Centrifugar el tubo a 50 x g y 4 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante que contiene células muertas y resuspender el pellet en 20 ml de la solución E. Tubos centrífugos a 50 x g y 4 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de la solución E. Compruebe el rendimiento y la viabilidad de los hepatocitos primarios utilizando la tinción azul de tripa. Cuente el número de celda usando una cámara de conteo de células Neubauer y ajuste la concentración celular a 3.75 x 105 células viables/ml. Mantenga las células en hielo. 6. Cultivo de hepatocitos primarios en sándwiches de colágeno 3D Preparar el medio de cultivo de hepatocitos (HCM). Añadir 15 ml de glucagón (1 mg/ml), 15 ml de hidrocortisona (50 mg/ml) y 40 ml de insulina (10 mg/ml) a 50 ml de medio completo (DMEM, glucosa alta, 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina). Dispersar uniformemente 2 ml (5 x 105 células/ml) de hepatocitos primarios viables en un plato pre-recubierto de 3,5 cm. Incubar las células con 5% de CO2 a 37oC durante 3 h. Importante: Distribuir uniformemente las células inclinando el plato en todas las direcciones justo antes de poner el plato en la incubadora. Preparar colágeno neutralizado I (plato de 100 l/3,5 cm; es decir, un volumen suficiente para todos los platos como se describió anteriormente [paso 2.1]). Manténgase en hielo hasta su uso. Después de 3 h, retire cuidadosamente las células medianas y no unidas y agregue 100 ml de colágeno neutralizado I a cada plato de 3,5 cm para formar la capa superior de sándwich de colágeno en las células. Incubar el sándwich de colágeno en condiciones de cultivo celular estándar (5% CO2 a 37 oC) durante 1 h. Después de una incubación de 1 h, agregue cuidadosamente 2 mL de HCM. Después de 24 h de cultura, cambie el medio HCM por uno nuevo. Cultivo durante 3-8 días, dependiendo de la formación de canales biliares. Compruebe el cultivo todos los días bajo un microscopio (Figura 4). Cambie el HCM cada segundo día. 7. Inmunoetiquetado de hepatocitos primarios en sándwiches de colágeno 3D Retire los medios de los sándwiches de hepatocitos y, a continuación, lávelos cuidadosamente con PBS precalentado. Fijar los cultivos sándwich con 1 mL de 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Después de la fijación, lavar los sándwiches 3x durante 10 min en 2 mL de PBS + 0.1% Tween 20 (PBS-T). Permeabilizar células con 1 ml de glicina de 0,1 M, 0,2% de Tritón X-100 en PBS a RT durante 1 h. Lavar 3 x durante 10 min en PBS-T. Perturbe suavemente la capa superior de colágeno usando una punta de carga de 10 s conectada a una aspiración de vacío para asegurar una penetración suficiente de anticuerpos. Bloquear con 1 ml de 5% de BSA en PBS-T (es decir, solución de bloqueo) durante 2 h. Incubar con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a 37 oC. Lavar 3 veces durante 15 min en PBS-T. Después del lavado, incubar con anticuerpo secundario a 37oC durante 5 h. Lavar 3 veces durante 15 min en PBS-T seguido de 1 lavado con H2O destilado. Montaje con medios de montaje anti-fade (ver Tabla de Materiales)para microscopía.