בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

כל ניסויי החיות בוצעו לפי הדירקטיבה האירופאית 2010/63/האיחוד האירופי ואושרו על ידי הנציבות המרכזית הצ לרווחת בעלי חיים. 1. חומרים בעלי חיים בבית תחת תנאים ללא פתוגן ספציפי על פי ההנחיות של הפדרציה לחקר בעלי חיים מעבדה האגודות עם גישה חופשית אוכל רגיל ושתיית מים. בעלי חיים מתחת למחזור כהה/מהיר של 12 שעות. לצורך הבידוד והתרבות, השתמשו בחיות בן 8 – 12 שבועות. פתרונות מניות A ו-B הכן פתרון מניות A ופתרון מניות B לפי טבלה 1 ושולחן 2, בהתאמה, מראש. מפזר את כל הרכיבים ב 1 L של מזוקק H2o (dH2o). להתאים את ה-pH של פתרונות כדי 7.2 ולסנן את הפתרונות באמצעות פילטר 0.2 יקרומטר. ניתן לאחסן את שני הפתרונות ב -4 ° c עד 6 חודשים. פתרון מניות C הכינו פתרון סי ביום הבידוד. הראשוני של הפאציט הוסף את כל הרכיבים בהתאם לטבלה 3, מלא לנפח הכולל 50 ML עם dH2O, והתמוססות. כוונן את ה-pH ל-7.3. 50 mL של הפתרון בצינורות 50 mL. . השתמש בצינור אחד לכל חיה מניחים את כל התוספות הנדרשות באמבט מים מחומם מראש (37 ° c). פתרון מניות D הכינו פתרון D ביום הבידוד הראשוני של הפאציט. הוסף את כל הרכיבים בהתאם לטבלה 4, המשך לנפח הכולל של 30 מ ל עם dH2O והתמוססות. כוונן את ה-pH ל-7.3. מחלקים 30 מ ל של הפתרון בצינורות 50 mL. הוסף קולגן ואני (5 מ”ג/30 mL) לתוך פתרון D. השתמש באחד משני החלקים לכל חיה. מניחים את כל התוספות באמבט מים מחומם מראש (37 ° c). פתרון מניות E הכינו פתרון E ביום הבידוד הראשוני של hepatocyte. הוסף את כל הרכיבים לפי טבלה 5, מלא לאמצעי אחסון כולל של 50 ML עם dH2O והתמוססות. כוונן את ה-pH ל-7.3. 50 mL של הפתרון בצינורות 50 mL. הוסף אלבומין V (0.65 g/50 mL) לפתרון E. השתמש באחד משני המינים לכל חיה. מניחים את כל התוספות באמבט מים מחומם מראש (37 ° c). 2. הכנת כריכי קולגן הכינו את השכבה הראשונה. של כריך הקולגןהערה: לעבוד על קרח ולהשתמש פתרונות טרום מקורר, טיפים, צלחות, וצינורות כדי למזער את הגגנציה לא רצויה של קולגן I. לנטרל את הכמות הנדרשת של קולגן אני (מזנב חולדה) על פי פרוטוקול של היצרן. נפח של 100 μL של קולגן לנטרל (1.5 mg/mL) לכל מדגם ניסיוני (3.5 cm צלחת) נדרש. כדי להכין 1 mL של קולגן לנטרל (1.5 mg/mL), להוסיף 100 μL של 10x DMEM, 1.5 μL של 1M NaOH, ו 48.5 μL של dH2O לתוך 500 μl של קולגן (ריכוז מניות = 3 מ”ג/mL). בדוק את ה-pH של קולגן לנטרל עם נייר לקמוס (ה-pH צריך להיות ~ 7.5). לפזר 100 μL של פתרון קולגן לנטרל באופן שווה באמצעות מראש מקורר 200 μL טיפ על פני השטח של מערכת 3.5 ס”מ להגדיר על קרח. דגירה לילה תחת תנאי תרבות סטנדרטיים (חממה עם 5% CO2 ב 37 ° c). ביום של הבידוד הראשוני hepatocyte, להוסיף 1 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) PBS לשכבת הקולגן הראשון. אפשר לקולגן לעבור מחדש עבור 2-3 h ב 37 ° c. 3. הגדרת ציוד הכן את כל הציוד כמפורט ברשימת החומרים והגדר כמוצג באיור 1. 4. הליך כירורגי הרליד העכבר על ידי הזרקת השרירים של tiletamine (60 מ”ג/ק ג של משקל הגוף), זולפם (60 מ”ג/ק”ג), ו xylazine (4.5 מ”ג/ק”ג). לאחר מספר דקות, לאשר את ההרדמה הנכונה על ידי צביטה הבוהן. , אם החיה לא תגיב לצביטה. המשך ל-4.2 מניחים את העכבר מורדם על מחצלת לחיתוך וקלטת את הגפיים התחתונות והעליון כדי לתקן את העכבר במצב פרקדן. לנגב את הבטן עם 70% אתנול ולפתוח את הבטן עם חתך צורת V מאזור הערווה לרגליים הקדמיות. מקפלים את העור על החזה כדי לחשוף את חלל הבטן. מניחים את המשטח החוצה. תחת מיקרוסקופ מבתר לכופף מחט מזרק אינסולין (30 G) לזווית 45 °. לחשוף את האובלה הנחותה (IVC) על ידי הזזת המעיים והמעי הגס בכיוון caudal. מילוי 2.5 mL של מחמם טרום מחומם (37 ° c) פתרון C לתוך מזרק 2 מ ל עם צינורית. ודא שאין בועות אוויר בצינורית או במזרק. לפני הצינורית של IVC, למקם מחדש את האונות בכבד על ידי לחיצה עליהם עד הסרעפת עם ספוגית רטוב (PBS) כותנה. מניחים תפר משי סביב IVC ממש מתחת לכבד (איור 2א, ב). הכנס 10 μL של הפארין (5000 U/mL) לתוך הווריד הפורטל באמצעות מזרק אינסולין עם מחט של 30 גרם כפוף בזווית 45 ° (איור 2ג). כדי צינורית הכבד, לעשות חתך קטן עם מספריים יקרוכירורגית ל-ivc ישירות ליד הכבד (מתחת תפר; איור 2ד) זה גדול מספיק כדי להכניס את הצינורית. אבטחו את הצינורית בתנוחה באמצעות תפרים ושתי קשרים כירורגיים (איור 2E). חותכים את הווריד השער (איור 2F) כדי לאפשר למאגרי ההיתוך לזרום מהכבד כדי למנוע התרחבות של הכבד. באופן ידני את הכבד עם 1.5 מ ל של הפתרון הטרום מחומם C על ידי לחיצה איטית על המזרק המחובר לצינורית (זה צריך לקחת ~ 15 s). הסרת דם מהכבד על ידי שינוי צבע של הכבד יכול עכשיו להיות נצפתה. מילוי משאבה פריסטלטית עם התקן טרום מחומם (37 ° c) C. בדוק את מכשיר ההיתוך וודא כי אין בועות אוויר במערכת. נתק בזהירות את הצינורית ממזרק וחבר אותו לצינורות של המשאבה הפריסטלטית הפועלת בקצב הזרימה של 2.5 mL/min. עבודה במהירות אך בזהירות ולהבטיח כי צינורית נשאר בעמדה וכי אין בועות להיכנס אבובים או צינורית. מבשם הכבד עם פתרון C עבור 2 דקות (5 מ”ל של פתרון C). לשנות את הפתרון D ולהמשיך את הפרזיה עבור 10 דקות נוספות (25 מ ל של פתרון D). , ברגע שהכבד הושם את הכבד. הסירו אותו מחלל הבטן הכבד יהיה כעת מאוד שברירי וחיוור בצבע (איור 3). 5. בידוד ההיפאציטים הראשוניים להסיר את הכבד מהעכבר. הצינורית עדיין תהיה קשורה לכבד, לכן השתמשו בלקחיים כדי להרים את הצינורית עם הכבד, ולנתק בזהירות את כל החיבורים הfascia. העבר את הכבד לצינור 50 mL המכיל 20 מ ל של הפתרון הטרום מחומם E. להחזיק את הצינורית עם הכבד באמצעות מלקחיים ולנתק את הרקמה על ידי לשפשף את הכבד סביב הקיר של הצינור כדי להעביר את hepatocytes מבודדים לתוך המאגר. . השאר את התאים המבודדים בקרחהערה: האסכולה ההפאציטים המרכזית מבודדת במשך מספר שעות, תוך שמירה על הקרח. משתמשים יכולים לחזור על שלבים 4.1 עד 5.2 בידוד החרופציטים ראשונית מעכבר תורם אחר, אם יש צורך, או להמשיך לשלב הבא. מקום מסננת תא ניילון 70 יקרומטר על גבי שפופרת 50 mL ולסנן את התאים המבודדים. צנטריפוגה את הצינור ב 50 x g ו 4 ° c עבור 5 דקות.. מרוב הסופרנטאנט כדי להסיר תאים מתים ולהגדיל את אחוז התאים קיימא, להשעות מחדש את הגלולה ב 20 מ ל של 40% percol ב DMEM. צנטריפוגה את הצינור ב 50 x g ו 4 ° צ’ עבור 5 דקות. הסופר המכיל תאים מתים והשהה מחדש את הגלולה ב 20 מ ל של פתרון E. צינורות צנטריפוגה ב 50 x g ו 4 ° צ’ עבור 5 דקות. ומכה את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של פתרון E. בדקו את התפוקה והכדאיות הראשונית של ההיפטציט באמצעות טריטין כתמים. ספור את מספר התאים באמצעות תא של מונה תאים מנויבאואר וכוונן את הריכוז של התא ל-3.75 x5 תאים מתאימים/mL. . השאר את התאים על הקרח 6. טיפוח של המופיציטים ראשוניים בכריכים קולגן תלת-ממדיים הכינו את התרבות הבינונית-מדיום (HCM). הוסף 15 μl של גלוקגון (1 מ”ג/ml), 15 μl של הידרוקורטיזון (50 מ”ג/ml), ו 40 μl של אינסולין (10 מ”ג/ml) כדי 50 mL של בינוני מלא (dmem גלוקוז גבוה, 10% fbs, 1% פניצילין-סטרפטומיצין). לפזר באופן שווה 2 מ ל (5 x 105 תאים/ml) של hepatocytes הראשי קיימא בצלחת מצופה מראש 3.5 ס מ. מודחת התאים עם 5% CO2 ב 37 ° c עבור 3 h. חשוב: לפזר באופן שווה את התאים על ידי הטיית הצלחת בכל הכיוונים רק לפני לשים את התבשיל לתוך החממה. להכין קולגן נטרל I (100 μL/3.5 ס”מ צלחת; כלומר, נפח מספיק עבור כל הכלים כמתואר לעיל [שלב 2.1]). . המשיכו להשתמש בקרח עד השימוש לאחר 3 שעות, בזהירות להסיר את התאים בינונית ובלתי מחוברת ולהוסיף 100 μL של קולגן לנטרל אני כל 3.5 ס”מ צלחת ליצור את השכבה העליונה של כריך קולגן על התאים. מודטה את כריך הקולגן בתנאים הסטנדרטיים התרבות התא (5% CO2 ב 37 ° c) עבור 1 h. לאחר הדגירה 1 h, בזהירות להוסיף 2 מ ל של HCM. לאחר 24 שעות של תרבות, לשנות את המדיום HCM עבור אחד טרי. תרבות במשך 3 – 8 ימים, בהתאם להיווצרות מיכל המרה. בדוק את התרבות כל יום תחת מיקרוסקופ (איור 4). שנה את ה-HCM כל יום שנייה. 7. אימונוולבלינג של הפטציטים ראשוניים בכריכים קולגן תלת-ממדיים להסיר את המדיה מסנדוויצ hepatocyte, ולאחר מכן לשטוף בזהירות עם הקדם מחומם PBS. תקן את תרבויות סנדוויץ עם 1 מ ל של 4% פאראמפורמלדהיד ב-PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר קיבעון, לשטוף את הסנדוויצ 3x עבור 10 דקות ב 2 מ ל של PBS + 0.1% רצף 20 (PBS-T). תאים מחלחלים עם 1 מ ל של 0.1 M גליצין, 0.2% טריטון X-100 ב-PBS ב RT עבור 1 h. לשטוף את 3x עבור 10 דקות ב-PBS-T. בעדינות להפריע את השכבה העליונה של קולגן באמצעות 10 μL טעינת טיפ מחובר שאיפה ואקום כדי להבטיח חדירה מספקת נוגדן. בלוק עם 1 מ ל של 5% BSA ב PBS-T (כלומר, חסימת פתרון) עבור 2 h. מודלת עם נוגדנים העיקרי מדולל בפתרון חסימת לילה ב 37 ° c. לרחוץ את 3x עבור 15 דקות ב-PBS-T. לאחר כביסה, דגירה עם נוגדן משני ב 37 ° c עבור 5 h. לשטוף 3x עבור 15 דקות ב-PBS-T ואחריו לשטוף 1x עם מזוקקים H2O. מאונט עם מדיה הרכבה נגד עמעום (ראה טבלת חומרים) למיקרוסקופיה.