İzolasyon ve 3D Kollajen Sandviç Kültürü Birincil Fare Hepatositler Safra Canaliküler Oluşumunda Sitoskeleton Rolünü Çalışma In Vitro

Tüm hayvan deneyleri Avrupa Direktifi 2010/63/EU uyarınca yapılmıştır ve Çek Hayvan Refahı Merkez Komisyonu tarafından onaylanmıştır. 1. Malzemeler Düzenli yemek ve içme suyuna ücretsiz erişim ile Laboratuvar Hayvan Bilim Dernekleri Federasyonu yönergelerine göre belirli patojen içermeyen koşullar altında Ev hayvanları. 12 h/12 h karanlık/ışık döngüsü altında ev hayvanları. Hepatosit izolasyonu ve kültürü için 8-12 haftalık hayvanları kullanın. A ve B stok çözümleri Stok çözeltisi A ve stok çözeltisi B’yi sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2’yegöre önceden hazırlayın. Tüm bileşenleri distile H2O (dH2O) 1 L’de çözün. Çözeltilerin pH’ını 7,2’ye ayarlayın ve çözümleri 0,2 μm’lik bir filtre ile filtreleyin. Her iki çözelti de 4 °C’de 6 aya kadar saklanabilir. Stok çözeltisi C Birincil hepatosit izolasyon gününde C çözeltisini hazırlayın. Tablo 3’e göre tüm bileşenleri ekleyin, dH2O ile 50 mL toplam hacmi doldurun ve çözünür. pH’ı 7.3 olarak ayarlayın. Aliquot 50 mL tüplerde çözeltinin 50 mL’si. Hayvan başına bir tüp kullanın. Gerekli tüm aliquotları önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin. Stok çözeltisi D Birincil hepatosit izolasyon gününde D çözeltisini hazırlayın. Tablo 4’egöre tüm bileşenleri ekleyin, dH2O ile 30 mL toplam hacmi doldurun ve çözünür. pH’ı 7.3 olarak ayarlayın. Aliquot çözeltisinin 30 mL’si 50 mL tüplerde. Çözeltiiçine kollajenaz I (5 mg/30 mL) ekleyin D. Hayvan başına bir aliquot kullanın. Tüm aliquotları önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin. Stok çözümü E Birincil hepatosit izolasyon gününde Çözelti E’yi hazırlayın. Tablo 5’e göre tüm bileşenleri ekleyin, dH2O ile 50 mL toplam hacmi doldurun ve çözünün. pH’ı 7.3 olarak ayarlayın. Aliquot 50 mL tüplerde çözeltinin 50 mL’si. Çözeltiye albumin V (0.65 g/50 mL) ekleyin E. Hayvan başına bir aliquot kullanın. Tüm aliquotları önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin. 2. Kollajen sandviç hazırlanması Birincil hepatosit izolasyonundan bir gün önce, kollajen I sandviçinin ilk tabakasını hazırlayın.NOT: Buzun üzerinde çalışın ve kollajen I’in istenmeyen jelasyonunu en aza indirmek için önceden soğutulmuş solüsyonlar, ipuçları, plakalar ve tüpler kullanın. Üreticinin protokolüne göre gerekli miktarda kollajen I’yi (fare kuyruğundan) nötralize edin. Deneysel numune başına (3,5 cm çanak) 100 μL nötralize kollajen (1,5 mg/mL) hacim gereklidir. 1 mL nötralize kollajen (1.5 mg/mL) hazırlamak için 100 μL 10x DMEM, 1.5 μL 1M NaOH ve 48.5 μL dH2O 500 μL kollajen (stok konsantrasyonu = 3 mg/mL) ekleyin. Turnusol kağıdı ile nötralize kollajen pH kontrol edin (pH ~ 7.5 olmalıdır). 100 μL nötralize kollajen çözeltisini, önceden soğutulmuş 200 μL’lik bir ucu buz üzerinde 3,5 cm’lik bir kabın yüzeyine eşit olarak dağıtın. Standart kültür koşullarında bir gecede kuluçkaya yat (37 °C’de %5 CO2 ile kuvöz). Primer hepatosit izolasyongününde ilk kollajen tabakasına önceden ısıtılmış (37 °C) PBS 1 mL ekleyin. Kollajen 37 °C’de 2-3 saat rehydrate sağlar. 3. Ekipman kurulumu Malzemeler Tablosu’nda listelenen ve Şekil 1’degösterildiği gibi ayarlanan tüm ekipmanları hazırlayın. 4. Cerrahi işlem Kiremitamin (60 mg/kg vücut ağırlığı), zolazepam (60 mg/kg) ve ksilazin (4.5 mg/kg) intramüsküler enjeksiyonu ile fareyi anestezi altına alın. Birkaç dakika sonra, parmak tutam tarafından uygun anestezi onaylayın. Hayvan kıskacına yanıt vermezse, 4.2’ye doğru ilerleyin. Anestezili fareyi bir diseksiyon minyonu üzerine yerleştirin ve fareyi bir supine pozisyonda düzeltmek için alt ve üst ekstremiteleri bantlayın. % 70 etanol ile karın bezi ve ön bacaklara kasık bölgesinden V şeklinde bir kesi ile karın açın. Karın boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde cilt katlayın. Diseksiyon paspasını bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin. Bir insülin şırınga iğnesini (30 G) 45° açıya bükün. Inferior vena kava maruz (IVC) kaudal yönde bağırsak ve kolon hareket ettirerek. 2,5 mL önceden ısıtılmış (37 °C) çözeltic çözeltisini 2 mL’lik bir şırınga yayla doldurun. Kanül veya şırıngada hava kabarcığı olmadığından emin olun. IVC kanülasyonu önce, ıslak (PBS) pamuk lu bez ile diyafram kadar basarak karaciğer lobları yeniden konumlandırmak. IVC’nin etrafına karaciğerin hemen altına bir ipek sütür yerleştirin(Şekil 2A,B). 45° açıda 30 G iğne bükülmüş bir insülin şırıngası kullanarak portal vene 10 μL heparin (5000 U/mL) enjekte edin(Şekil 2C). Karaciğer kanüle için, doğrudan karaciğer yanında IVC mikrocerrahi makas ile küçük bir kesi yapmak (dikiş altında; Şekil 2D) kanül eklemek için yeterince büyük. Kanülleri dikiş ve iki cerrahi düğüm(Şekil 2E)kullanarak pozisyonda sabitle. Perfüzyon tamponlarının karaciğerin genişlemesini önlemek için karaciğerden dışarı akmasını sağlamak için portal damarı(Şekil 2F)kesin. Kanüle bağlı şırıngaya yavaşça basarak karaciğeri 1,5 mL önceden ısıtılmış çözelti C ile elle takın (bu ~ 15 s almalıdır). Karaciğerde renk değişikliği ile karaciğerden kan çıkarılması artık görülebilir. Peristaltik bir pompayı önceden ısıtılmış (37 °C) solüsyonuyla önceden doldurun C. Perfüzyon cihazını kontrol edin ve sistemde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kanunu şırıngadan dikkatlice çıkarın ve 2,5 mL/dk akış hızında çalışan peristaltik pompanın tüpüne bağlayın. Karaciğeri 2 dk (5 mL çözelti C) için C çözeltisi ile perfüzyonlayın. D çözeltisine değiştirin ve ek 10 dakika (25 mL çözelti D) için perfüzyona devam edin. Karaciğer perfüzyon sonra, karın boşluğundan çıkarın. Karaciğer şimdi çok kırılgan ve renk soluk olacak(Şekil 3). 5. Primer hepatositlerin izolasyonu Fareden karaciğeri çıkarın. Kanül hala karaciğerbağlı olacak, bu yüzden karaciğer ile kanül kaldırmak için forseps kullanın, ve dikkatle tüm fasya bağlantıları kesti. Karaciğeri 20 mL önceden ısıtılmış çözelti E içeren 50 mL’lik bir tüpe aktarın. Büşremakkullanarak karaciğer ile kanül tutun ve tampon içine izole hepatosit aktarmak için tüp duvar etrafında karaciğer sürtünme doku ayırmak. İzole edilmiş hücreleri buzda tut.NOT: İzole primer hepatositler buzüzerinde tutulurken birkaç saat kullanılabilir. Kullanıcılar gerekirse başka bir donör fareden 4.1 ile 5.2 arasında yalıtım lı birincil hepatositleri yineleyebilir veya bir sonraki adıma geçebilir. 50 mL’lik bir tüpün üzerine 70 m naylon hücreli süzgeç yerleştirin ve izole edilmiş hücreleri filtreleyin. Tüpü 5 0 x g ve 4 °C’de 5 dk. Aspire etmek için santrifüj edin. Ölü hücreleri ortadan kaldırmak ve canlı hücrelerin yüzdesini artırmak için, DMEM’de peletin 20 mL’lik ve percol’un yeniden askıya alınması. Tüpü 5 0 x g ve 4 °C’de 5 dk. Ölü hücreler içeren süpernatantı aspire edin ve 20 mL çözeltisi E’de peleti yeniden askıya alın. 5 dk. 5 dk. Aspire ve çözelti E 10 mL pelet resuspend 50 x g ve 4 °C’de santrifüj tüpler. Trypan mavisi boyama kullanarak birincil hepatosit verimini ve canlılığını kontrol edin. Neubauer hücre sayma odasını kullanarak hücre numarasını sayın ve hücre konsantrasyonu 3.75 x 105 canlı hücre/mL olarak ayarlayın. Hücreleri buzda tut. 6. 3D kollajen sandviçlerde primer hepatosit ekimi Hepatosit kültür ortamı (HCM) hazırlayın. 15 μL glukagon (1 mg/mL), 15 μL hidrokortizon (50 mg/mL) ve 40 μL insülin (10 mg/mL) ila 50 mL tam orta (DMEM, yüksek glikoz, FBS, %1 penisilin-streptomisin) ekleyin. Önceden kaplanmış 3,5 cm’lik bir tabağa 2 mL (5 x 105 hücre/mL) uygun primer hepatositleri eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 °C’de %5 CO2 ile 3 7 °C’de kuluçkaya yatırın. Nötralize kollajen I (100 μL/3.5 cm çanak; yani yukarıda açıklandığı gibi tüm yemekler için yeterli hacimde [adım 2.1]) hazırlayın. Kullanıma kadar buzda tutun. 3 saat sonra, dikkatle orta ve bekar hücreleri kaldırmak ve hücreler üzerinde kollajen sandviç üst tabakası nı oluşturmak için her 3,5 cm çanak nötralize kollajen I 100 μL ekleyin. Kollajen sandviçi standart hücre kültürü koşullarında (37 °C’de %5 CO2) 1 saat süreyle kuluçkaya yatırın. 1 saat kuluçkadan sonra 2 mL HCM’yi dikkatlice ekleyin. Kültürün 24 saat sonra, taze bir hCM orta değiştirin. Kültür 3-8 gün, safra canaliculi oluşumuna bağlı olarak. Kültürü her gün mikroskop altında kontrol edin (Şekil 4). HCM’yi her saniye değiştirin. 7. 3D kollajen sandviçlerde primer hepatositlerin immünetiketlemesi Ortamı hepatosit sandviçlerinden çıkarın, ardından önceden ısıtılmış PBS ile dikkatlice yıkayın. Sandviç kültürlerini PBS’de %4 paraformaldehit 1 mL oda sıcaklığında 30 dakika (RT) düzeltin. Fiksasyondan sonra sandviçleri 10 dk boyunca 3 x 2 mL PBS + %0.1 Ara 20 (PBS-T) yıkayın. 0,1 M glisin 1 mL, RT’de PBS’de %0.2 Triton X-100 ile permeabilize hücreler 1 saat. PBS-T’de 10 dk boyunca 3x yıkayın. Yeterli antikor penetrasyonu sağlamak için vakum aspirasyonuna bağlı 10 μL yükleme ucu kullanarak kollajenin üst tabakasını nazikçe bozun. PBS-T’de %5 BSA ile (yani bloklama çözeltisi) 2 saat boyunca 37 °C’de bloklama çözeltisinde seyreltilmiş primer antikorlarla inkübül. PBS-T’de 15 dk boyunca 3x yıkayın. Yıkandıktan sonra 37 °C’de 5 saat boyunca ikincil antikorla inkübasyon 15 dk pbs-t’de 3x yıkayın ve ardından damıtılmış H2O ile 1x yıkayın. Mikroskop için solma önleyici montaj ortamına (bkz. Malzeme Tablosu)monte edin.