JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Изоляция и 3D коллаген сэндвич культуры первичных гепатоцитов мыши для изучения роли цитоскелета в Bile Canalicular Формирование в Vitro

Published: December 20, 2019
doi:
10.3791/60507
, , ,
1Laboratory of Integrative Biology,Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Summary

Представлен протокол для изоляции гепатоцитов мыши от печени взрослых мышей с использованием модифицированной методики перфузии коллагенеза. Также описана долгосрочная культура гепатоцитов в 3D коллагенсэндвиче, а также иммуномаркировка цитоскелетных компонентов для изучения образования желчных каналикуляров и его реакции на лечение.

Abstract

Гепатоциты являются центральными клетками печени, отвечающими за ее метаболическую функцию. Таким образом, они образуют однозначно поляризованный эпителий, в котором два или более гепатоцитов способствуют апикальных мембран, образуя желчь канализациической сети, через которую выделяется желчь. Поляризация гепатоцитов необходима для правильного формирования каналикуляров и зависит от взаимодействия между цитоскелетом гепатоцитов, клеточными контактами и внеклеточной матрицей. В пробирке исследования гепатоцитов цитоскелет атравимы участия в формировании canaliculi и его ответ на патологические ситуации препятствуют отсутствие клеточной культуры, которая будет очень похож на структуру сети canaliculi in vivo. Описано здесь протокол для изоляции гепатоцитов мыши от печени взрослой мыши с помощью модифицированного метода перфузии коллагенеза. Также описано производство культуры в 3D коллагенсэндвич настройки, которая используется для иммуномаркировки компонентов цитоскелета для изучения желчных каналикулярных формирования и его ответ на лечение в пробирке. Показано, что гепатоцит3D коллагена сэндвич культур реагировать на лечение с токсинами (этанол) или актин цитоскелет изменения наркотиков (например, блеббистатин) и служить ценным инструментом для в пробирке исследования желчных каналикули формирования и функции.

Introduction

Гепатоциты, центральные клеточные структуры печени, которые отвечают за ее метаболические функции, являются однозначно поляризованными эпителиальными клетками. Их поляризация, появляющаяся у млекопитающих вскоре после рождения, приводит к образованию желчной каналикулярной сети и необходима для правильной секреции желчи. Аптические мембраны гепатоцитов коллективно образуют желчь canaliculi, в то время как базальные мембраны остаются в контакте с эндотелием синусоидов. Потеря поляризации гепатоцитов приводит к перераспределению транспортеров желчи и приводит к патологическим процессам, связанным с задержкой желчи в печени (т.е. холестаз).

Создание и поддержание поляризации гепатоцитов и развитие желчных каналикули влечет за собой сложные механизмы. Основные процессы зависят от коллективного взаимодействия между цитоскелетом гепатоцитов, контактами клеток и взаимодействиями с внеклеточной матрицей1. Цитоскелет гепатоцитов состоит из всех трех сетей нити, актина цитоскелет, микротрубочки, и промежуточных нитей, которые обеспечивают структурную поддержку каналикулярного образования. Дифференциальная роль компонентов цитоскелета в регенерации и поддержании желчных каналических сетей ранее была проиллюстрирована in vitro в 3D коллаген-сэндвич гепатоцитных культурах2.

Актин микрофиламентов и микротрубочек имеют важное значение на начальных стадиях поляризации мембраны гепатоцитов в местах генерации canaliculus2. Актин цитоскелет устанавливает структуру и функцию желчных каналикули, образуя мембранно-ассоциированные микрофилеты и окружное кольцо, тем самым поддерживая каналическую архитектуру и вставляя актиновый цитоскелет в плотные и придерживающиеся узлов3. Кольцо кератиновых промежуточных нитей за пределами актина цитоскелета еще больше стабилизирует каналикулярную структуру3.

Важность белков в гепатоцитных стыковочных комплексах в организации желчных каналикули архитектуры была хорошо документирована в нескольких выбивания моделей мыши, которые показывают искаженные каналикули у мышей, не хватает как жесткие и / или приверженцев соединения белков4,5,6. Удаление адептов соединения белка-катенина, как было показано, приводит к дезорганизации гепатоцитов актин цитоскелет, расширение желчных каналикулярных люменов, вытекающей жесткой соединения, и эффективно холестатический фенотип4. Кроме того, исследования in vitro показали важность связующих компонентов соединения E-кадерин и q-катенин в реконструкции гепатоцеллю apical lumen и торговли белками7.

Поразительно, абляция цитоскелет кросспригвации белка плектин, который является основным организатором кератина, выявил фенотипы сопоставимы с теми, которые связаны с актина цитоскелет8. Это говорит о решающей роли кератина промежуточных нитей в поддержке каналикулярной структуры. В пробирке исследования с использованием 3D гепатоцитов коллагена бутерброды также показали важность AMP активированного белка киназы и его восходящий активатор LKB1 в желчных каналикулярныхсетейформирования 9 . Эти выводы были затем дополнительно подтверждены последующими исследованиями in vivo10,11. Таким образом, стало ясно, что исследования in vitro необходимы для углубления понимания сигнальных процессов, связанных с установлением поляризации гепатоцитов, надлежащего формирования каналикулярной сети и секреции желчи.

Основной проблемой в изучении процессов, связанных с образованием желчи и его реакцией на патологические ситуации in vitro, является использование условий клеточной культуры, которые очень напоминают ситуацию in vivo12. Свежеизолированные первичные гепатоциты не поляризуются; таким образом, они теряют свою функцию, морфологию и функциональные желчные каналикули в 2D-культурных условиях (например, изменения в регуляции генов, поляризации и дедифференциации13,14,15). Несмотря на это факт, свежеизолированные гепатоциты наиболее точно отражают природу печени invivo, в отличие от печено-производных клеточных линий16. Даже если они были использованы в прошлом, увековеченные клеточные линии не оказывают эпителиально-как характерная морфология гепатоцитов, и желчные каналикулярные люмены, образованные этими клетками напоминают печень canaliculi плохо7. В последнее время 3D культур первичных гепатоцитов, как от мышей и крыс, стали полезным инструментом для изучения процессов, связанных с образованием желчных каналикулярных сетей in vitro9. Первичные гепатоциты, культивированные между двумя слоями коллагена (именуемые 3D коллагеном, могут быть повторно поляризованы в течение нескольких дней. Из-за высоких технических требований, необходимых при культивировании мышей гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах, здесь мы представляем сложный протокол для изоляции, культивирования, и иммуномаркировки мыши гепатоцитов, встроенных в 3D коллагенбутерброды бутерброды для того, чтобы охарактеризовать участие цитоскелетных компонентов во время формирования желчных каналов.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU и были одобрены Чешской центральной комиссией по защите животных. 1. Материалы Домашние животные в специфических условиях без патогенов в соответствии с руководящими принципами Федерации лабораторных ассоциаций наукоемких животных с бесплатным доступом к регулярной чау и питьевой воде. Домашние животные под циклом темного/света 12 h/12 h. Для изоляции гепатоцитов и культуры используйте животных в возрасте 8–12 недель. Фондовые решения A и B Подготовьте биржевое решение A и биржевое решение B в соответствии с таблицей 1 и таблицей 2,соответственно, заранее. Растворите все компоненты в 1 l дистиллированной H2O (dH2O). Отрегулируйте рН растворов до 7.2 и отфильтруйте растворы через фильтр 0,2 мкм. Оба раствора могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение 6 месяцев. Фондовое решение C Подготовьте раствор С в день первичной изоляции гепатоцитов. Добавьте все компоненты в соответствии с таблицей 3, заполните до 50 мл общего объема с dH2O, и растворите. Отрегулируйте рН до 7,3. Aliquot 50 мл раствора в 50 мл труб. Используйте одну трубку на одно животное. Поместите все необходимые аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию). Акционерное решение D Подготовьте раствор D в день первичной изоляции гепатоцитов. Добавить все компоненты в соответствии с таблицей 4, заполнить до 30 мл общий объем с dH2O, и растворить. Отрегулируйте рН до 7,3. Aliquot 30 мл раствора в 50 мл труб. Добавить коллагенеза I (5 мг/30 мл) в раствор D. Используйте один аликот на животное. Поместите все аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию). Биржевое решение E Подготовьте раствор E в день первичной изоляции гепатоцитов. Добавьте все компоненты в соответствии с таблицей 5, заполните до 50 мл общего объема с dH2O, и растворите. Отрегулируйте рН до 7,3. Aliquot 50 мл раствора в 50 мл труб. Добавьте альбумин V (0,65 г/50 мл) в раствор E. Используйте один аликот на животное. Поместите все аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию). 2. Приготовление коллагеновых сэндвичей За день до первичной изоляции гепатоцитов, подготовить первый слой коллагена I бутерброд.ПРИМЕЧАНИЕ: Работа на льду и использовать предварительно охлажденные растворы, советы, пластины и трубки, чтобы свести к минимуму нежелательное гелирование коллагена I. Нейтрализовать необходимое количество коллагена I (из крысиного хвоста) в соответствии с протоколом производителя. На экспериментальный образец (3,5 см) требуется объем нейтрализации коллагена (1,5 мг/мл). Для приготовления 1 мл нейтрализованного коллагена (1,5 мг/мл) добавьте 100 л 10x DMEM, 1,5 л из 1 МН НаОХ и 48,5 л dH2O в 500 л коллагена (концентрация запасов 3 мг/мл). Проверьте рН нейтрализованного коллагена с лакмусовой бумагой (рН должен быть 7,5 евро). Рассеять 100 л нейтрализованного раствора коллагена равномерно, используя предварительно охлажденный 200 л оконечности над поверхностью 3,5 см блюдо, установленное на льду. Инкубировать ночь в стандартных условиях культуры (инкубатор с 5% CO2 при 37 градусах Цельсия). В день первичной изоляции гепатоцитов добавьте 1 мл предварительно разогретого (37 градусов По Цельсию) PBS к первому коллагеновому слою. Разрешить коллагена для регидратации в течение 2-3 ч при 37 градусах Цельсия. 3. Оборудование настроено Подготовьте все оборудование, указанное в таблице материалов, и установите, как показано на рисунке 1. 4. Хирургическая процедура Анестезия мыши путем внутримышечной инъекции плитки (60 мг/кг массы тела), золазепама (60 мг/кг) и ксилазина (4,5 мг/кг). Через несколько минут, подтвердить надлежащее анестезии на ноге щепотку. Если животное не реагирует на щепотку, перейдите на 4.2. Поместите обезопаживающую мышь на коврик для вскрытия и засучив нижние и верхние конечности, чтобы зафиксировать мышь в положении на спине. Swab живот с 70% этанола и открыть живот с V-образным разрезом от лобковой области до передних ног. Сложите кожу на грудь, чтобы раскрыть брюшную полость. Поместите рассекающий коврик под рассекающим сядр микроскопом. Согните иглу инсулинового шприца (30 G) под углом 45 градусов. Выставляют нижнюю полину вены (IVC), перемещая кишечник и толстую кишку в каудальном направлении. Заполните 2,5 мл предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) раствора С в шприц 2 мл с канюлей. Убедитесь, что в канюле или шприцах нет пузырьков воздуха. Перед cannulation IVC, изменить положение доли печени, нажав их до диафрагмы с мокрой (PBS) ватным тампоном. Поместите шелковый шов вокруг IVC чуть ниже печени(Рисунок 2A, B). Введите 10 л гепарина (5000 U/mL) в вену портала с помощью инсулинового шприца с иглой 30 G, согнутой под углом 45 градусов(рисунок 2С). Чтобы канитование печени, сделать небольшой разрез с микрохирургическими ножницами в IVC непосредственно рядом с печенью (ниже шва; Рисунок 2D), который достаточно велик, чтобы вставить канюли. Закрепите канюлу в положении с помощью швов и двух хирургических узлов(рисунок 2E). Вырезать вену портала(Рисунок 2F), чтобы перфузии буферов вытекать из печени, чтобы предотвратить расширение печени. Вручную пронизываете печень 1,5 мл предварительно разогретого раствора С, медленно нажимая шприц, подключенный к канюле (это должно занять 15 с). Удаление крови из печени путем обесцвечивания печени теперь можно наблюдать. Предварительно заполните перистальтический насос предварительно подогретым (37 градусов по Цельсию) раствором C. Проверьте перфузийный аппарат и убедитесь, что в системе нет пузырьков воздуха. Осторожно отключите канюлю от шприца и подключите ее к трубам перистальтического насоса, работающего со скоростью потока 2,5 мл/мин. Работайте быстро, но осторожно и убедитесь, что канюля остается в положении и что никакие пузырьки не попадают в трубку или канюлю. Пронизываете печень раствором С в течение 2 мин (5 мл раствора С). Измените раствор D и продолжайте перфузию еще 10 мин (25 мл раствора D). После того, как печень была проникнута, удалить его из брюшной полости. Печень теперь будет очень хрупкой и бледного цвета(рисунок 3). 5. Изоляция первичных гепатоцитов Удалите печень из мыши. Канюля будет по-прежнему привязаны к печени, так что используйте щипцвы, чтобы поднять канюли с печенью, и тщательно отрезать все соединения фасции. Перенесите печень в трубку 50 мл, содержащую 20 мл предварительно прогретого раствора Е. Держите канюли с печенью с помощью щипков и отмежевать ткани, потирая печень вокруг стенки трубки для передачи изолированных гепатоцитов в буфер. Держите изолированные клетки на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные первичные гепатоциты жизнеспособны в течение нескольких часов, сохраняя на льду. Пользователи могут повторить шаги 4.1 до 5.2 изоляции первичных гепатоцитов от другой донорской мыши, если это необходимо, или приступить к следующему шагу. Поместите 70 мкм нейлоновой ячейки ситечко на вершине 50 мл трубки и фильтровать изолированные клетки. Центрифуга трубки на 50 х г и 4 кв к в течение 5 мин. Аспирируй супернатант. Чтобы удалить мертвые клетки и увеличить процент жизнеспособных клеток, resuspend гранулы в 20 мл 40% percol в DMEM. Центрифуги трубки на 50 х г и 4 кв в течение 5 мин. Аспирировать супернатант, содержащий мертвые клетки и resuspend гранулы в 20 мл раствора Е. Центрифуги трубки на 50 х г и 4 кв в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в 10 мл раствора Е. Проверьте первичный выход гепатоцитов и жизнеспособность с помощью trypan синий окрашивания. Подсчитайте номер ячейки с помощью камеры подсчета клеток Нойбауэр и отрегулируйте концентрацию клеток до 3,75 х 105 жизнеспособных ячеек/мл. Держите клетки на льду. 6. Культивирование первичных гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах Подготовка гепатоцитов культуры среды (HCM). Добавьте 15 кл глюкагона (1 мг/мл), 15 л гидрокортизона (50 мг/мл) и 40 л инсулина (10 мг/мл) до 50 мл полной среды (DMEM, высокая глюкоза, 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина). Равномерно рассеять 2 мл (5 х 105 клеток/мл) жизнеспособных первичных гепатоцитов в предварительно покрытой 3,5 см блюдо. Инкубировать клетки с 5% CO2 при 37 градусах по Цельсию на 3 ч. Важно: Равномерно распределить клетки, наклоняя блюдо во всех направлениях непосредственно перед тем, как положить блюдо в инкубатор. Приготовьте нейтрализованный коллаген I (100 л/3,5 см блюдо; т.е. достаточный объем для всех блюд, как описано выше ,шаг 2.1). Держите на льду до использования. После 3 ч тщательно удалите средние и неприсоединенные клетки и добавьте 100 кЛ нейтрализованного коллагена I к каждому 3,5 см блюду, чтобы сформировать верхний слой коллагена бутерброд на клетках. Инкубировать сэндвич с коллагеном в стандартных условиях клеточной культуры (5% CO2 при 37 градусах Цельсия) на 1 ч. После 1 ч инкубации, тщательно добавьте 2 мл HCM. После 24 ч культуры, изменить среду HCM на свежий. Культура в течение 3-8 дней, в зависимости от образования желчных каналикули. Проверьте культуру каждый день под микроскопом(рисунок 4). Изменение HCM каждый второй день. 7. Иммуномаркировка первичных гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах Удалите средства массовой информации из гепатоцитов бутерброды, а затем тщательно мыть с предварительно подогретых PBS. Исправьте культуры сэндвича с 1 мл 4% параформальдегида в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре (RT). После фиксации, мыть бутерброды 3x в течение 10 минут в 2 мл PBS 0,1% Tween 20 (PBS-T). Пермяки клетки с 1 мл 0,1 м глицин, 0,2% Тритон X-100 в PBS на RT для 1 ч. Вымойте 3x на 10 мин в PBS-T. Аккуратно нарушить верхний слой коллагена, используя 10 л погрузочный наконечник подключен к вакуумной аспирации для обеспечения достаточного проникновения антител. Блок с 1 мл 5% BSA в PBS-T (т.е. блокирующий раствор) для 2 ч. Инкубировать с первичными антителами, разбавленными в блокирующем растворе на ночь при 37 градусах Цельсия. Вымойте 3x в течение 15 мин в PBS-T. После мытья, инкубировать со вторичными антителами при 37 кс на 5 ч. Вымойте 3x в течение 15 минут в PBS-T следуют 1x мыть с дистиллированной H2O. Гора с анти-увядание монтажа средств (см. Таблица материалов) для микроскопии.

Representative Results

Мышиные первичные гепатоциты были выделены и посеяны в 3D коллагеновы бутерброды. Bile canaliculi между двумя смежными клетками начали образовываться в течение нескольких часов после посева. Клетки образовывали кластеры и самоорганизовывались в приблизительно регулярной сети желчных каналикули в течение 1 дня(рисунок 4). В течение 3-6 дней, кластеры 5-10 клеток, как правило, наблюдались, с полностью поляризованными гепатоцитов формирования каналикулярной сети(рисунок 4). Лечение первичных гепатоцитов мыши в 3D коллагеновых сэндвичах с токсином (этанол) или цитоскелет-изменяющими препараты (например, blebbistatin, окадаиновая кислота) привело к изменениям в гепатоцитцит цитоскелет, canaliculi ширина, форма, и количество желчных каналикули иллюстрируется иммуномаркировки с антитела к кератину 8 (наиболее обильные кератина в гепатоцитов), фаллоидин (визуализация F-актин), и антитела к жесткой белка перекресток zon-ocquo Рисунок 5). Лечение этанолом оказало лишь легкое воздействие на организацию кератина 8; однако, это увеличило мучительность (как видно из F-актина окрашивания) и распределение желчных каналикулярных ширин(рисунок 5). Интенсивность сигнала окрашивания ЗО-1 была снижена в этанол-обработанных желчных каналикули по сравнению с необработанными контроля, что свидетельствует о потере жестких узлов после лечения этанола. Ингибирование актомиозина контрактильность с блеббистатином значительно повлияло на форму и количество желчных каналикули. Регулярная каналикулярная сеть была реорганизована, по сравнению с необработанными гепатоцитами, в беспорядочную форму желчных каналикули с повышенной частотой толстых округлых желчных каналикули вместо тонких длинных (как видно в гистограмме каналикулярной ширины). Кроме того, лечение окадановой кислотой (ОА), ингибирующей фосфатазы сильно влияет на физические свойства кератинов, как ранее показано8,17. ОА изменяет растворимость кератиновных нитей; таким образом, лечение привело к глубокой реорганизации кератина сетки, которая рухнула на большие перинуклеарные агрегаты. Как F-актин, так и плотный протеин соединения ЗО-1 не были локализованы в какие-либо конкретные структуры, что свидетельствует о почти полном исчезновении организованных желчных каналикули и полной потере полярности гепатоцитов. Остальные желчные каналикули были значительно сужены по сравнению с необработанными элементами управления, как видно на гистограмме ширины каналикулярной(рисунок 5). Для корреляции микроскопических наблюдений изменений в цитоскелете гепатоцитов с гепатоцелликальной биохимической реакцией на лечение, протокол также измерил уровни аланина аминотрансферазы (ALT) и аспартата трансаминаза (АСТ) (два фермента печени, которые обычно используются в качестве маркеров гепатоцеллической травмы) в супернатанте из 3D коллагеновых сэндвичей… . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Лечение этанолом значительно повысило уровень как АЛТ, так и АСТ, что свидетельствует о серьезной гепатоцеллюлярной травме. Лечение blebbistatin не привело к каким-либо значительным изменениям в уровнях ALT и AST по сравнению с окадановой кислотой лечения, которое вызвало мягкие биохимические изменения с повышенным уровнем ALT, но никаких изменений в уровнях АСТ. Таким образом, биохимические маркеры гепатоцеллюлярной травмы измеряются в пробирке от гепатоцитов супернатанта, коррелирующих с цитоскелетными изменениями, наблюдаемыми иммуностогированием. Рисунок 1: Экспериментальная настройка. (A)Мышь, закрепленная в положении на спине, помещается под рассекающим микроскопом перед операцией. Все необходимые хирургические инструменты помещаются на поднос. (B) Perfusion Suite во время перфузии печени мыши показаны силиконовые трубки подключения резервуарс с теплым буфером и проникнуты мыши. (C) Схематическое представление B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Открытие брюшной полости и каниляция IVC. Брюшко открывается V-образным разрезом от лобковой области до передних ног. Кожа складывается над грудью, чтобы разоблачить и увеличить брюшную полость. Чтобы разоблачить IVC, кишечник и толстая кишка тщательно перемещаются caudally. (A, B) Перед cannulation IVC, доли печени должны быть перемещены путем нажатия их вверх к диафрагме с PBS-мокрый ватный тампон. IVC затем тщательно отделены от окружающих тканей, и шелковый шов помещается вокруг IVC в непосредственной близости от печени. Панель B представляет схемы брюшной полости, показанные в панели А. Указаны доли печени, кишечник, нижняя полая вена (IVC, красный) и швы. (C) Гепарин вводится в вену портала (PV, стрелка) с инсулиновым шприцем (30 G игла согнута под углом 45 “). (D) Чтобы канюляции печени, IVC вырезованный непосредственно рядом с печенью (ниже шва). (E) Канюля вставляется и закреплены швами, связывая два хирургических узлов. (F) Вены портала полностью вырезать, чтобы свободный отток буфера, предотвращая расширение печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Представитель изображения печени до и после перфузии. (A, B) Канированная печень была резечена и проникнута в течение 12 мин при скорости потока 2,5 мл/мин. Обратите внимание на значительно обесцвеченную печень после перфузии (B) по сравнению с свежерезеченной печенью (А). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: 3D коллаген сэндвич культуры первичных гепатоцитов мыши. Представитель ярко-поля изображения мыши первичных гепатоцитов культивируется в течение 1, 2 и 3 дней в 3D условиях. Следует отметить, что более крупные кластеры высокоорганизованных клеток образуются после 3 дней в культуре. Коробок области показывают 3x увеличенные изображения. Стрелы указывают на желчь canaliculi. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Оценка морфологического ответа на токсический стресс с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Первичные гепатоциты мыши, культивированные в 3D коллагеновых сэндвичах, лечились токсинами (этанол, блеббистатин или окадаевская кислота) на 3-й день культуры. Фиксированные клетки были окрашены для визуализации цитоскелетных компонентов: кератин 8 (зеленый), F-актин (красный), и zonula occludens-1 (ЗО-1, пурпурный) иммунофлуоресценции. Токсическая обработка привела к дезорганизации визуализированных цитоскелетных компонентов, а также к уменьшению количества и увеличению мучительности желчных каналикули. Ширина каналикуляров измерялась как в необработанных, так и в обработанных гепатоцитах и изображалась как гистограммы распределения ширины. Стрелы указывают на желчь canaliculi. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Биохимический анализ реакции 3D гепатоцитов коллагена бутерброды с токсичными травмами в пробирке. ALT и AST, устоявшиеся маркеры гепатоцеллюлярной травмы, были измерены в супернатанте из 3D гепатоцитов коллагена бутерброды, обработанные токсинами (этанол, блеббистатин, и окадаиновая кислота). ALT и AST были повышены в обработанных клетках по сравнению с необработанными. Данные сообщаются как арифметические средства – SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Фондовый решение A (10x) Реагента Окончательная концентрация (г/литр) Nacl 80 Kcl 4 MgSO4No7H2O 1.97 Na2HPO4No2H2O 0.598 KH2PO4 0.6 Таблица 1: Биржевое решение A рецепт. Фондовый раствор B (10x) Реагента Окончательная концентрация (г/литр) Nacl 69 Kcl 3.6 KH2PO4 1.30 MgSO4No7H2O 2.94 CaCl2 2.772 Таблица 2: Рецепт фондового раствора B. Решение C Реагента Фондовый решение A (10x) 5 мл NaHCO3 0,1094 г EGTA 0,0095 г dH2O до 50 мл Таблица 3: Рецепт фондового раствора C. Решение D Реагента Стоковое решение A (10x) 3 мл NaHCO3 0,065 г CaCl2 0,0125 г dH2O до 30 мл Таблица 4: Рецепт фондового раствора D. Решение E Реагента Стоковое решение B (10x) 5 мл NaHCO3 0,1 г Глюкозы 0,045 г dH2O до 50 мл Таблица 5: Биржевое решение E рецепт.

Discussion

Использование мыши первичной гепатоцитов культур имеет важное значение для исследований в пробирке, чтобы лучше понять сигнальные процессы, участвующие в создании поляризации гепатоцитов, надлежащего формирования каналикулярной структуры, и секреции желчи. Проблемы в изоляции и долгосрочной культуре мыши первичных гепатоцитов в 2D-культуре привели к изобретению нескольких технических подходов с повышенной изоляционностью и долговечностью изолированных клеток, каждый из которых имеет несколько преимуществ и Недостатки. В настоящее время широко признано, что 2D культуры первичных гепатоцитов имитируют лишь ограниченное количество атрибутов биологии печени в течение короткого периода времени. Таким образом, 3D-культивирование в расположении сэндвича коллагена широко заменяет 2D условия, особенно когда сосредоточено на функции цитоскелета в биологии печени (например, токсические лекарственные эффекты или пространственная организация переноса желчи).

С 1980-х годов было описано несколько протоколов изоляции гепатоцитов мыши с различными модификациями. Двухступенчатый коллагенеза перфузии подход стал широко использоваться во многих лабораториях. Добавление градиентной центрифугирования в протокол изоляции позволяет удалить мертвые клетки19,20 и значительно увеличивает количество жизнеспособных клеток (здесь, обычно до 93%). Несмотря на то, что этот шаг расширяет время обработки клеток и приводит к уменьшению числа клеток21, этот шаг рассматривается как необходимый в 3D коллагена сэндвич культуры для надлежащего образования желчных каналикулярной сети. Кроме того, более важно действовать быстро и точно во время перфузионных шагов, что сокращает время обработки клеток.

Другими важными факторами, повышающие жизнеспособность клеток и их способность юбилярной сети в 3D, является использование свежеприготовленных растворов и избегание пузырьков во время перфузии. Поэтому решения должны быть подготовлены в день изоляции гепатоцитов мыши, а перистальтический насос и трубки должны быть проверены при смене растворов. Если соблюдать протокол, то изоляция первичных гепатоцитов должна быть успешной с высокой урожайностью жизнеспособных клеток.

Другим важным фактором в долгосрочной культуре 3D гепатоцитов является первоначальный источник первичных гепатоцитов, которые используются. Важно использовать животных, которым от 8 до 12 недель, которые служат оптимальными донорами гепатоцитов. Использование гепатоцитов пожилых животных было не столь успешным в долгосрочной культуре, так как эти гепатоциты меняли свою морфологию чаще, деполяризовали и перестали формировать каналикулярные сети. Кроме того, нашивание гепатоцитов на правильно нейтрализованном коллагеновом геле, образованном из относительно высококонцентрированного раствора, является жизненно важным шагом. В большинстве протоколов используются концентрации около 1 мг/мл. После многих оптимизаций, концентрация 1,5 мг/мл является оптимальной для долгосрочного выращивания гепатоцитов и обеспечивает высокоорганизованные гепатоциты с сформированными желчных каналикули.

Этот простой в последующей протокол позволяет долгосрочное выращивание первичных гепатоцитов мыши. Представитель результаты демонстрируют широкий спектр использования для 3D культивированных первичных гепатоцитов мыши при изучении роли цитоскелетных компонентов в формировании желчных каналикули.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Грантагентством Чешской Республики (18-02699S); Грантовое агентство Министерства здравоохранения Чешской Республики (17-31538A); Институциональный исследовательский проект Чешской академии наук (RVO 68378050) и проекты MEYS CR (L-1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI C.1.05/2.1.00/19.0395, и OP RDE C.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775); Карлов университет (личная стипендия К.К.), а также проект оперативной программы «Прага-конкурентоспособность» (C.2.16/3.1.00/21547). Мы признательна За поддержку с помощью микроскопии, IMG CAS, Prague, Czech Republic (поддерживаемые MEYS CR проекты LM2015062 и LO1419).

Materials

35 mm TC-treated culture dish Corning 430165
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance VWR 525-0156
70 µm nylon cell strainer Biologix 15-1070
Albumin Fraction V ROTH 8076.4
Arteriotomy Cannula (1mm) Medtronic 31001
Calcium Chloride Sigma-Aldrich P5655
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) Corning 354249
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) Sigma-Aldrich C5138
D(+) glucose monohydrate ROTH 6780.1
Dissecting microscope Zeiss Stemi 508
DMEM, high glucose Sigma-Aldrich D6429
EGTA ROTH 3054.2
FBS Gibco 10270-106
Glucagon Sigma-Aldrich G-2044
Glycine Pufferan G 05104
Heparin (5000 U/mL) Zentiva 8594739026131
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888
Insulin Sigma-Aldrich I9278
Insulin syringe (30G) BD Medical 320829
Magnesium Sulphate Heptahydrate ROTH T888.1
microsurgical forceps FST 11252-20
microsurgical forceps FST 11251-35
microsurgical scissor FST 15025-10
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Percoll Sigma-Aldrich P1644
Peristaltic Pump Minipuls Evolution Gilson F110701, F110705
Potassium Chloride ROTH 6781.1
Potassium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fischer Scientific P10144
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810 R
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 VWR 630-2124
Silk braided black Chirmax EP 0.5 – USP 7/0
Sodium Chloride ROTH 3957.1
Sodium Hydrogen Carbonate Sigma-Aldrich 30435
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate Sigma-Aldrich 30435
Syringe 2 ml Chirana CH002L
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Water bath Nuve NB 9
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm Sigma-Aldrich WHA7402004
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 GE Healthcare Life Sciences 2629-990
Zoletil Vibrac VET00083
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
  2. LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
  3. Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
  4. Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
  5. Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
  6. Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
  7. Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
  8. Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
  9. Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, 3294-3302 (2010).
  10. Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
  11. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  12. Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
  13. Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A. Repolarization of hepatocytes in culture. Hepatology. 25 (1), 167-172 (1997).
  14. Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
  15. Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
  16. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  17. Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
  18. Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
  19. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  20. Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
  21. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).

Tags

3D Collagen Sandwich CulturePrimary Mouse HepatocytesBile Canalicular FormationCytoskeletonLiver IsolationHepatocyte IsolationIn Vitro StudiesPerfusionHeparinDMEMCollagen IPBSCell Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro. J. Vis. Exp. (154), e60507, doi:10.3791/60507 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image