체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

모든 동물 실험은 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었으며 체코 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다. 1. 재료 일반 차우와 식수에 무료로 액세스 할 수있는 실험실 동물 과학 협회 연맹의 지침에 따라 특정 병원균이없는 조건하에서 동물을 수용하십시오. 12 h/12 h/12 h의 어두운/빛 주기 하에 동물을 하우스합니다. 간세포의 고립과 문화를 위해 8-12주된 동물을 사용하십시오. 재고 솔루션 A 및 B 표 1과 표 2에따라 재고 솔루션 A와 재고 솔루션 B를 각각 사전에 준비합니다. 증류된 H 2 O(dH2O)의1L에 모든성분을용해시. 솔루션의 pH를 7.2로 조정하고 0.2 μm 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. 두 솔루션 모두 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 재고 솔루션 C 1 차 간세포 격리 당일 용액 C를 준비하십시오. 표 3에 따라 모든 구성 요소를 추가하고 dH2O로 총 부피를 50mL로 채우고 용해하십시오. pH를 7.3으로 조정합니다. 50 mL 튜브에서 용액의 50 mL. 동물 당 하나의 튜브를 사용하십시오. 필요한 모든 알리쿼트들을 예열된 수조(37°C)에 놓습니다. 재고 솔루션 D 1 차 간세포 격리 당일 용액 D를 준비하십시오. 표 4에따라 모든 구성 요소를 추가하고 dH2O로 30 mL 총 부피를 채우고 용해하십시오. pH를 7.3으로 조정합니다. 50 mL 튜브에서 용액의 30 mL. 콜라게나제 I(5 mg/30 mL)을 용액 D. 동물당 1개의 알리쿼트(aliquot)를 사용하십시오. 모든 알리쿼트(aliquots)를 예열된 수조(37°C)에 놓습니다. 재고 솔루션 E 1차 간세포 격리 당일 용액 E를 준비합니다. 표 5에 따라 모든 구성 요소를 추가하고 dH2O로 총 부피를 50mL로 채우고 용해하십시오. pH를 7.3으로 조정합니다. 50 mL 튜브에서 용액의 50 mL. 알부민 V(0.65 g/50 mL)를 용액 E. 동물당 하나의 알리쿼트(aliquot)에 추가합니다. 모든 알리쿼트(aliquots)를 예열된 수조(37°C)에 놓습니다. 2. 콜라겐 샌드위치 준비 1 차 간세포 분리 전에 하루, 콜라겐 I 샌드위치의 첫 번째 층을 준비합니다.참고: 얼음을 바르고 미리 차갑게 한 용액, 팁, 플레이트, 튜브를 사용하여 콜라겐 I의 원치 않는 겔화를 최소화하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 필요한 양의 콜라겐 I(쥐 꼬리에서)을 중화시다. 실험 샘플(3.5 cm 접시)당 중화 콜라겐(1.5 mg/mL)의 부피가 필요합니다. 중화 콜라겐 1 mL(1.5 mg/mL)을 준비하려면 100 μL의 DMEM 100μL, 1M NaOH의 1.5 μL, 48.5 μL의 dH2O를 콜라겐 500 μL(재고 농도 = 3 mg/mL)을 추가합니다. 리트머스 종이로 중화 콜라겐의 pH를 확인하십시오 (pH는 ~ 7.5여야합니다). 얼음 위에 놓인 3.5cm 접시의 표면에 미리 차가운 200 μL 팁을 사용하여 중화 콜라겐 용액 100 μL을 고르게 분산시. 표준 배양 조건하에서 하룻밤 동안 배양하십시오 (37 °C에서 5 %CO2가있는 인큐베이터). 1차 간세포 분리의 날에, 첫 번째 콜라겐 층에 미리 온난(37°C) PBS 1 mL을 추가합니다. 콜라겐이 37°C에서 2-3시간 동안 수분을 보충합니다. 3. 장비 설정 그림 1과같이 재료 표에 나열된 대로 모든 장비를 준비하고 설정합니다. 4. 외과 적 수술 타일타민 (체중 60 mg/kg), 졸라제팜 (60 mg /kg), 자일라진 (4.5 mg /kg)의 근육 주사로 마우스를 마취시. 몇 분 후, 발가락 핀치에 의해 적절한 마취를 확인하십시오. 동물이 핀치에 반응하지 않으면 4.2로 진행하십시오. 마취된 마우스를 해부 매트 위에 놓고 아래쪽및 상지의 테이프를 붙이고 마우스를 척추 위치에 고정시다. 70 % 에탄올로 복부를 면봉하고 음모 부위에서 앞다리까지 V 자형 절개로 복부를 엽니다. 복강을 밝히기 위해 가슴에 피부를 접습니다. 해부 매트를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 인슐린 주사기 바늘(30G)을 45° 각도로 구부립니다. 꼬리 방향으로 장과 결장이동하여 열등한 정맥(IVC)을 노출시다. 2.5 mL의 미리 온난(37°C) 용액 C를 캐뉼라로 2 mL 주사기에 채웁니다. 캐뉼라 나 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오. IVC의 통조림 전에 젖은 (PBS) 면봉으로 횡격막까지 눌러 간 엽을 재배치하십시오. 간 바로 아래에 IVC 주위에 실크 봉합사를 놓습니다(그림 2A,B). 45° 각도로 구부러진 30G 바늘로 인슐린 주사기를 사용하여 10 μL의 헤파린 (5000 U/mL)을 문맥에 주입하십시오(그림 2C). 간을 담조로이하려면, 간 바로 옆에 IVC에 미세 수술 가위로 작은 절개를 (봉합사 아래; 도 2D)는캐뉼라를 삽입할 수 있을 만큼 충분히 크다. 봉합사와 두 개의 수술 매듭을 사용하여 위치에 캐뉼라를 고정하십시오(그림 2E). 관류 완충제가 간에서 흘러 나와 간이 팽창하는 것을 방지할 수 있도록 문맥(그림2F)을잘라낸다. 캐뉼라에 연결된 주사기를 천천히 눌러 미리 데운 용액 C의 1.5 mL로 간을 수동으로 침전시하십시오 (이것은 ~ 15 s가 소요됩니다). 간변색에 의한 간에서 혈액을 제거하는 것을 이제 관찰 할 수 있습니다. 연동 펌프를 미리 데운(37°C) 용액C. 관류 장치를 확인하고 시스템에 기포가 없는지 확인합니다. 조심스럽게 주사기에서 캐뉼라를 분리하고 2.5 mL / min의 유량속도로 작동하는 연동 펌프의 튜브에 연결하십시오. 2 분 동안 용액 C (용액 C의 5 mL)로 간을 침전시하십시오. 용액 D로 변경하고 추가로 10 분 동안 관류를 계속 (용액 D의 25 mL). 간이 침투되면 복강에서 제거하십시오. 간은 이제 매우 깨지기 쉽고 창백한 색이 될 것입니다(그림 3). 5. 1 차 간세포의 격리 마우스에서 간을 제거합니다. 캐뉼라는 여전히 간과 연결되어 있으므로 집게를 사용하여 간으로 캐뉼라를 들어 올리고 모든 근막 연결을 조심스럽게 차단하십시오. 미리 온난한 용액 E의 20 mL를 포함하는 50 mL 관에 간을 전송합니다. 집게를 사용하여 간과 캐뉼라를 잡고 분리 된 간을 완충물로 옮기기 위해 튜브 벽 주위에 간을 문질러 조직을 분리하십시오. 얼음에 고립 된 세포를 유지합니다.참고 : 고립 된 기본 간세포는 얼음에 보관하는 동안 몇 시간 동안 실행 가능합니다. 사용자는 4.1~5.2단계의 1차 간세포를 다른 기증자 마우스로부터 분리하거나, 필요한 경우, 또는 다음 단계로 진행할 수 있다. 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 50 mL 튜브 위에 놓고 분리 된 세포를 필터링하십시오. 튜브를 50 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 죽은 세포를 제거하고 생존 세포의 비율을 증가시키기 위해, DMEM에 있는 40% 퍼콜의 20 mL에 있는 펠릿을 다시 중단하십시오. 튜브를 50 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 죽은 세포를 함유하는 상월체를 흡인하고 용액 E의 20 mL에서 펠릿을 다시 중단한다. 원심분리기 튜브를 50 x g 및 4°C에서 5분 동안 흡인하고 용액 E의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 트라이판 블루 염색을 사용하여 기본 간세포 수율과 생존가능성을 확인하십시오. Neubauer 세포 카운팅 챔버를 사용하여 세포 수를 계산하고 세포 농도를 3.75 x 105 생존 세포/mL로 조정합니다. 얼음에 세포를 유지합니다. 6. 3D 콜라겐 샌드위치로 1차 간세포 재배 간세포 배양 배지(HCM)를 준비합니다. 완전한 배지(DMEM, 고당포도, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 글루카곤 15μL(1 mg/mL), 하이드로코르티손 15μl(50 mg/mL), 인슐린 40 μL(10 mg/mL)을 추가합니다. 미리 코팅된 3.5cm 접시에 2 mL(5 x 105 세포/mL)의 생존 가능한 1차 간세포를 고르게 분산시다. 37 °C에서 5%CO2로 세포를 배양하는 것이 중요합니다. 중화 콜라겐 I (100 μL / 3.5 cm 접시, 즉, [단계 2.1]에 설명 된 모든 요리에 대한 충분한 볼륨을 준비합니다. 사용 전까지 얼음을 유지하십시오. 3 시간 후, 조심스럽게 배지와 부착되지 않은 세포를 제거하고 각 3.5 cm 접시에 중화 콜라겐 I 100 μL을 추가하여 세포에 콜라겐 샌드위치의 최상층을 형성합니다. 콜라겐 샌드위치를 표준 세포 배양 조건(37°C에서 5%CO2)에서 1시간 동안 배양합니다. 1 시간 배양 후, 조심스럽게 HCM 2 mL을 추가하십시오. 배양 24시간 후, HCM 배지를 변경하여 신선한 배지로 바꿉니다. 담즙 카날리큘리의 형성에 따라 3-8 일 동안 배양하십시오. 현미경으로 매일 배양을 확인한다(그림4). 두 번째 날마다 HCM을 변경합니다. 7. 3D 콜라겐 샌드위치의 1 차 간세포의 면역 라벨링 간세포 샌드위치에서 미디어를 제거한 다음 미리 데운 PBS로 조심스럽게 씻으하십시오. 샌드위치 배양액을 PBS에서 4% 파라포름알데히드 1mL로 실온(RT)에서 30분 동안 고정합니다. 고정 후, 샌드위치를 3x 10분 동안 PBS 2 mL + 0.1% 트웬 20(PBS-T)으로 세척합니다. 0.1 M 글리신의 1 mL, 0.2 % 트리톤 X-100을 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 10 분 동안 3x 씻어 내다. 충분한 항체 침투를 보장하기 위해 진공 흡인에 연결된 10 μL 로딩 팁을 사용하여 콜라겐의 상부 층을 부드럽게 방해합니다. PBS-T(즉, 차단 용액)에서 1 mL의 BSA를 2시간 동안 차단하여 1차 항체를 밤새 37°C에서 차단용액으로 희석한 1차 항체로 인큐베이팅한다. PBS-T에서 15분 동안 3x를 씻으소서. 세척 후, 이차 항체를 37°C에서 5h. PBS-T에서 15분 동안 3x 세척한 다음 증류된H2O로 1x 세척한 후 배양합니다. 현미경 검사용 안티 페이드 장착 용지(재료 표참조)로 마운트합니다.