Présenté ici est un protocole pour l’isolement des hépatocytes de souris des foies adultes de souris utilisant une technique modifiée de perfusion de collagène. On décrit également la culture à long terme des hépatocytes dans un arrangement 3D de sandwich de collagène aussi bien que l’immunolabeling des composants cytosquelettiques pour étudier la formation canaliculaire biliaire et sa réponse au traitement.
Les hépatocytes sont les cellules centrales du foie responsables de sa fonction métabolique. En tant que tels, ils forment un épithélium polarisé unique, dans lequel deux hépatocytes ou plus contribuent membranes apicales pour former un réseau canaliculaire biliaire à travers lequel la bile est sécrétée. La polarisation d’hépatocyte est essentielle pour la formation canaliculaire correcte et dépend des interactions entre le cytosquelette d’hépatocyte, les contacts de cellule-cellule, et la matrice extracellulaire. Les études in vitro de la participation de cytosquelette d’hépatocyte dans la formation de canaliculi et de sa réponse aux situations pathologiques sont handicapées par le manque de culture cellulaire, qui ressemblerait étroitement à la structure de réseau de canaliculi in vivo. Décrit ici est un protocole pour l’isolement des hépatocytes de souris du foie adulte de souris utilisant une technique modifiée de perfusion de collagène. On décrit également la production de la culture dans un arrangement 3D de sandwich de collagène, qui est employé pour l’immunolabeling des composants cytoskeletal pour étudier la formation canaliculaire biliaire et sa réponse aux traitements in vitro. Il est démontré que les cultures de sandwichs au collagène 3D d’hépatocyte s’adressent aux traitements avec des toxines (éthanol) ou des cytosquelettes d’actine qui modifient les médicaments (p. ex. la blebbistatin) et servent d’outil précieux pour les études in vitro de la formation et de la fonction du canalcisique bilique.
Les hépatocytes, les structures cellulaires centrales du foie qui sont responsables de ses fonctions métaboliques, sont des cellules épithéliales polarisées uniques. Leur polarisation, apparaissant chez les mammifères peu de temps après la naissance, entraîne la formation du réseau canaliculaire biliaire et est essentielle pour une sécrétion biliaire appropriée. Les membranes apicales des hépatocytes forment collectivement des canauxudes biliaire, tandis que les membranes basales restent en contact avec l’endothélium des sinusoïdes. La perte de polarisation des hépatocytes entraîne une redistribution des transporteurs biliaire et entraîne des processus pathologiques liés à la rétention des bile dans le foie (c.-à-d. la cholémase).
L’établissement et le maintien de la polarisation des hépatocytes et le développement de la bile canaliculi impliquent des mécanismes complexes. Les processus sous-jacents dépendent de l’interaction collective entre le cytosquelette de l’hépatocyte, les contacts cellule-cellule, et les interactions avec la matrice extracellulaire1. Le cytosquelette d’hépatocyte se compose des trois réseaux de filament, le cytosquelette d’actine, les microtubules, et les filaments intermédiaires, qui fournissent le soutien structurel pour la formation canaliculaire. Le rôle différentiel des composants cytosquelettiques dans la régénération et l’entretien des réseaux canaliculaires biliaires a été précédemment illustré in vitro dans les cultures 3D d’hépatocyte de collagène-sandwich2.
Les microfilaments d’actine et les microtubules sont importants pendant les étapes initiales de la polarisation de membrane d’hépatocyte aux emplacements de la génération2de canaliculus. Le cytosquelette d’actine établit la structure et la fonction du canaliculi biliaire, formant des microfilaments membranaires et l’anneau circonférence, soutenant ainsi l’architecture canaliculaire et insérant le cytosquelette d’actine dans les jonctions serrées et adhérentes3. L’anneau de filaments intermédiaires de kératine à l’extérieur du cytosquelette d’actine stabilise davantage la structure canaliculaire3.
L’importance des protéines dans les complexes de jonction d’hépatocyte s’est avérée dans l’organisation de l’architecture canaliculi biliaire dans plusieurs modèles de souris knock-out, qui montrent des canauxuuli déformés chez les souris dépourvues de protéines de jonction serrées et/ou adhérentes4,5,6. La suppression de la protéine de jonction d’adhérents –caténine a été montrée pour mener à la désorganisation du cytosquelette d’actine d’hépatocyte, à la dilatation des lumens canaliculaires biliaires bile, aux jonctions serrées de fuite, et effectivement à un phénotype cholestatic4. En outre, des études in vitro ont montré l’importance des composants de jonction adhérents E-cadherin et ‘caténine dans le remodelage du lumen apical hépatocellulaire et le trafic de protéines7.
Étonnamment, l’ablation de la pléctine de protéine de croisement de cytosquelette, qui est l’organisateur principal de kératine, a indiqué des phénotypes comparables à ceux liés au cytosqueletted’actine 8. Ceci suggère un rôle critique des filaments intermédiaires de kératine en soutenant la structure canaliculaire. Des études in vitro utilisant des sandwichs au collagène d’hépatocyte 3D ont également montré l’importance de la kinase de protéine activée par l’AMP et de son activateur en amont LKB1 dans la formation de réseau canaliculaire biliaire9. Ces résultats ont ensuite été confirmés par des études in vivo ultérieures10,11. Ainsi, il est devenu clair que des études in vitro sont nécessaires pour approfondir la compréhension des processus de signalisation impliqués dans l’établissement de la polarisation des hépatocytes, la formation appropriée du réseau canaliculaire et la sécrétion biliaires.
Un défi majeur dans l’étude des processus liés à la formation canaliculaire biliaire et sa réponse à des situations pathologiques in vitro est d’utiliser une culture cellulaire conditions qui ressemblent étroitement à la situation in vivo12. Les hépatocytes primaires fraîchement isolés ne sont pas polarisés; ainsi, ils perdent leur fonction, morphologie, et canaliculi biliaire fonctionnel dans des conditions de culture 2D (par exemple, changements dans la régulation de gène, la polarisation, et la dédifférenciation13,14,15). Malgré cela, les hépatocytes fraîchement isolés reflètent le plus étroitement la nature du foie invivo, contrairement aux lignées cellulaires dérivées du foie16. Même si elles ont été utilisées dans le passé, les lignées cellulaires immortalisées n’exercent pas la morphologie caractéristique épithéliale des hépatocytes, et les lumens canaliculaires biliaires formés par ces cellules ressemblent mal au canaliculi hépatique7. Récemment, les cultures 3D des hépatocytes primaires, des souris et des rats, sont devenues un outil utile pour étudier les processus impliqués dans la formation de réseau canaliculaire bilique bile in vitro9. Les hépatocytes primaires cultivés entre deux couches de collagène (appelée culture sandwich au collagène 3D) peuvent se repolariser en plusieurs jours. En raison des exigences techniques élevées exigées en cultivant des hépatocytes de souris dans des sandwichs de collagène 3D, ici nous présentons un protocole complexe pour isoler, cultiver, et pour immunolabel des hépatocytes de souris incorporés dans des sandwichs de collagène 3D afin de caractériser la participation des composants cytosquelettiques pendant la formation canaliculaire biliaire.
L’utilisation des cultures primaires d’hépatocyte de souris est importante pour des études in vitro pour mieux comprendre les processus de signalisation impliqués dans l’établissement de la polarisation d’hépatocyte, de la formation appropriée de structure canaliculaire, et de la sécrétion biliaires. Les défis dans l’isolement et la culture à long terme des hépatocytes primaires de souris dans la culture 2D ont conduit à l’invention de plusieurs approches techniques avec l’effectivité d’isolement accrue et la longévité des cellules isolées, chacune avec plusieurs avantages et Inconvénients. Il est maintenant largement admis que les cultures 2D des hépatocytes primaires imitent seulement un nombre limité d’attributs de la biologie hépatique pendant une courte période de temps. Ainsi, la culture 3D dans un arrangement de sandwich de collagène remplace largement les conditions 2D, particulièrement lorsqu’elles se concentrent sur la fonction du cytosquelette dans la biologie de foie (par exemple, les effets toxiques de drogue ou l’organisation spatiale du transport biliestif).
Depuis les années 1980, plusieurs protocoles d’isolement des hépatocytes de souris avec diverses modifications ont été décrits. L’approche de perfusion de collagène en deux étapes est devenue largement utilisée dans de nombreux laboratoires. L’ajout de centrifugation de gradient dans le protocole d’isolement permet l’enlèvement des cellules mortes19,20 et augmente considérablement le nombre de cellules viables (ici, systématiquement à 93%). Même si cette étape prolonge le temps de manipulation des cellules et entraîne une réduction des nombres cellulaires21,cette étape est considérée comme nécessaire dans la culture sandwich au collagène 3D pour la formation de réseau canaliculaire bilique bile appropriée. En outre, il est plus important de procéder rapidement et avec précision pendant les étapes de perfusion, ce qui raccourcit le temps que les cellules sont manipulées.
D’autres facteurs importants qui augmentent la viabilité des cellules et leur capacité à former des réseaux canaliculaires en 3D est l’utilisation de solutions fraîchement préparées et l’évitement des bulles pendant la perfusion. Par conséquent, les solutions doivent être préparées le jour de l’isolement des hépatocytes de souris, et la pompe péristtique et le tube doivent être vérifiés lors du changement de solutions. Si le protocole est suivi de près, l’isolement des hépatocytes primaires devrait être réussi avec un rendement élevé des cellules viables.
Un autre facteur critique dans la culture à long terme d’hépatocytes 3D est la source initiale des hépatocytes primaires qui sont employés. Il est important d’utiliser des animaux qui sont de 8 à 12 semaines, qui servent de donneurs optimaux d’hépatocytes. L’utilisation d’hépatocytes d’animaux plus âgés n’a pas été aussi réussie dans la culture à long terme, car ces hépatocytes ont changé leur morphologie plus souvent, dépolarisé, et ont cessé de former des réseaux canaliculaires. En outre, placage hépatocytes sur le gel de collagène correctement neutralisé formé à partir de solution relativement fortement concentrée est une étape essentielle. Dans la plupart des protocoles, des concentrations d’environ 1 mg/mL sont utilisées. Après de nombreuses optimisations, une concentration de 1,5 mg/mL est optimale pour la culture à long terme des hépatocytes et fournit des hépatocytes très organisés avec canaliculi bilique séminuen.
Ce protocole facile à suivre permet la culture à long terme d’hépatocytes de souris primaires. Les résultats représentatifs démontrent un large spectre d’utilisation pour les hépatocytes primaires de souris cultivés en 3D en étudiant le rôle des composants cytosquelettiques dans la formation de canaliculi bilique.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l’Agence des subventions de la République tchèque (18-02699S); l’Agence de subventions du Ministère de la santé de la République tchèque (17-31538A); projets de recherche institutionnelle de l’Académie tchèque des sciences (RVO 68378050) et des projets MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, et OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775); L’Université Charles (allocation personnelle à K.K.) et un projet de programme opérationnel Prague-Compétitivité (CZ.2.16/3.1.00/21547). Nous reconnaissons le Centre de microscopie légère, IMG CAS, Prague, République tchèque (soutenu MEYS CR projets LM2015062 et LO1419) pour le soutien avec l’imagerie microscopie présenté.
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |