Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU en ze werden goedgekeurd door de Tsjechische Centrale Commissie voor dierenwelzijn. 1. materialen Huisdieren onder specifieke pathogeen-vrije voorwaarden volgens de richtlijnen van de Federatie voor laboratorium Dierenwetenschap verenigingen met vrije toegang tot reguliere Chow en drinkwater. Huisdieren onder een 12 h/12 h donker/licht cyclus. Voor hepatocyten isolatie en cultuur, gebruik 8 – 12 week-oude dieren. Stock oplossingen A en B Bereid voorraad oplossing A en Stock Solution B volgens respectievelijk tabel 1 en tabel 2vooraf. Los alle componenten op in 1 L gedistilleerd H2o (DH2o). Pas de pH van de oplossingen aan 7,2 en filter de oplossingen door middel van een 0,2 μm filter. Beide oplossingen kunnen maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard. Stock oplossing C Bereid oplossing C op de dag van primaire hepatocyte-isolatie. Voeg alle componenten toe volgens tabel 3, vul aan tot een totaal volume van 50 ml met DH2O en los het op. Stel de pH in op 7,3. Aliquot 50 mL oplossing in buisjes van 50 mL. Gebruik één buis per dier. Plaats alle benodigde aliquots in een pre-warmed waterbad (37 °C). Stock oplossing D Bereid de oplossing D op de dag van de primaire isolatie van hepatocyte. Voeg alle componenten toe volgens tabel 4, vul aan tot een totaal volume van 30 ml met DH2O en los het op. Stel de pH in op 7,3. Aliquot 30 mL van de oplossing in buizen van 50 mL. Voeg Collagenase I (5 mg/30 mL) toe aan oplossing D. gebruik één aliquot per dier. Plaats alle aliquots in een pre-warmed waterbad (37 °C). Stock oplossing E Bereid oplossing E op de dag van primaire hepatocyte isolatie. Voeg alle componenten toe volgens tabel 5, vul aan tot een totaal volume van 50 ml met DH2O en los het op. Stel de pH in op 7,3. Aliquot 50 mL oplossing in buisjes van 50 mL. Voeg albumine V (0,65 g/50 mL) toe aan oplossing E. gebruik één aliquot per dier. Plaats alle aliquots in een pre-warmed waterbad (37 °C). 2. bereiding van collageen sandwiches Op een dag vóór primaire hepatocyten isolatie, bereid de eerste laag van de collageen I sandwich.Opmerking: werk op ijs en gebruik voorgekoelde oplossingen, tips, platen en buizen om ongewenste gelatie van collageen I te minimaliseren. Neutraliseer de benodigde hoeveelheid collageen I (van Rat tail) volgens het Protocol van de fabrikant. Een volume van 100 μL geneutraliseerde collageen (1,5 mg/mL) per experimenteel monster (schaal van 3,5 cm) is vereist. Om 1 mL geneutraliseerde collageen (1,5 mg/mL) te bereiden, voeg 100 μL 10x DMEM, 1,5 μL 1M NaOH en 48,5 μL dH2O toe aan 500 μl collageen (voorraad concentratie = 3 mg/ml). Controleer de pH van geneutraliseerde collageen met lakmoesproef papier (de pH moet ~ 7,5). Dispergeer 100 μL neutraliseerde collageen oplossing gelijkmatig met een voorgekoelde 200 μL tip over het oppervlak van een schaal van 3,5 cm op ijs. Incuberen ‘s nachts onder de standaard kweek condities (incubator met 5% CO2 bij 37 °c). Voeg op de dag van primaire hepatocyte isolatie 1 mL voorverwarmde (37 °C) PBS toe aan de eerste collageen laag. Laat het collageen rehydraat voor 2-3 h bij 37 °C. 3. uitrusting instellen Alle apparatuur zoals vermeld in de tabel van de materialen voorbereiden en instellen zoals weergegeven in Figuur 1. 4. chirurgische ingreep Anesthetiseer de muis door intramusculaire injectie van tiletamine (60 mg/kg lichaamsgewicht), zolazepam (60 mg/kg), en xylazine (4,5 mg/kg). Na enkele minuten, bevestig de juiste anesthetisering door de teen knijpen. Als het dier niet reageert op de Knijp, ga dan naar 4,2. Plaats de verdoofd Mouse op een dissectie mat en plak de onderste en bovenste extremiteiten om de muis in rugligging te bevestigen. Swab de buik met 70% ethanol en open de buik met een V-vorm incisie van de schaamstreek naar voorpoten. Vouw de huid over de borst om de buikholte te onthullen. Plaats de ontsnij mat onder een ontleed Microscoop. Buig een insulinespuit naald (30 G) in een hoek van 45 °. Stel de onderste vena cava (IVC) bloot door de darmen en de dikke darm in de caudale richting te bewegen. Vul 2,5 mL pre-warmed (37 °C) oplossing C in een 2 mL spuit met een canule. Zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes in de canule of spuit zitten. Vóór de cannulatie van de IVC, herpositioneer de lever lobben door ze op te drukken tot het diafragma met een natte (PBS) wattenstaafje. Plaats een zijhechting rond de IVC net onder de lever (Figuur 2a, B). Injecteer 10 μL heparine (5000 U/mL) in de portaal ader met behulp van een insulinespuit met een 30 G naald gebogen in een hoek van 45 ° (Figuur 2C). Om de lever te cannuleren, maak een kleine incisie met microchirurgische schaar aan de IVC direct naast de lever (onder de hecht; Figuur 2D) die groot genoeg is om de canule in te steken. Bevestig de canule in de positie met behulp van hechtingen en twee chirurgische knopen (Figuur 2E). Snijd de portaal ader (Figuur 2F) om de perfusie buffers uit de lever te laten vloeien om expansie van de lever te voorkomen. Parfumeer de lever handmatig met 1,5 mL voorverwarmde oplossing C door langzaam op de spuit te drukken die is aangesloten op de canule (dit moet ~ 15 s duren). De verwijdering van bloed uit de lever door verkleuring van de lever kan nu worden waargenomen. Pre-Vul een peristaltische pomp met voorverwarmde (37 °C) oplossing C. Controleer het perfusie-apparaat en zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes in het systeem zitten. Koppel voorzichtig de canule los van de spuit en sluit deze aan op de slang van de peristaltische pomp met een debiet van 2,5 mL/min. werk snel maar zorgvuldig en zorg ervoor dat de canule in positie blijft en dat er geen bubbels in de slang of canule komen. Parfumeer de lever met oplossing C gedurende 2 min (5 mL oplossing C). Verander naar oplossing D en ga verder met de perfusie voor nog 10 minuten (25 mL oplossing D). Zodra de lever is geperfectiongebruikt, verwijderen uit de buikholte. De lever zal nu zeer fragiel en bleke van kleur (Figuur 3). 5. isolatie van primaire hepatocyten Verwijder de lever van de muis. De canule zal nog steeds aan de lever worden gebonden, dus gebruik de tang om de canule met de lever op te tillen en alle fascia-verbindingen zorgvuldig af te snijden. Breng de lever over in een buis van 50 mL met 20 mL pre-warmed oplossing E. Houd de canule met de lever met behulp van een tang en ontkoppel het weefsel door de lever rond de wand van de buis te wrijven om de geïsoleerde hepatocyten in de buffer over te brengen. Houd de geïsoleerde cellen op ijs.Opmerking: geïsoleerde primaire hepatocyten zijn gedurende enkele uren levensvatbaar terwijl ze op ijs worden gehouden. Gebruikers kunnen stappen 4,1 tot en met 5,2 het isoleren van primaire hepatocyten van een andere donor muis, indien nodig, of doorgaan met de volgende stap herhalen. Plaats een 70 μm nylon celzeef bovenop een buis van 50 mL en filtreer de geïsoleerde cellen. Centrifugeer de buis bij 50 x g en 4 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatant. Om dode cellen verwijderen en verhogen van het percentage van levensvatbare cellen, respenderen de pellet in 20 mL 40% percol in DMEM. Centrifugeer de buis bij 50 x g en 4 °c gedurende 5 min. Zuig de supernatant met dode cellen op en hervat de pellet in 20 ml oplossing E. Centrifuge buizen bij 50 x g en 4 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatant en Redigeer de pellet in 10 ml oplossing E. Controleer de primaire opbrengst van hepatocyten en de levensvatbaarheid met behulp van trypan blauwe kleuring. Tel het celnummer met behulp van een Neubauer-celtelkamer en pas de celconcentratie aan 3,75 x 105 levensvatbare cellen/ml. Houd de cellen op ijs. 6. teelt van primaire hepatocyten in 3D collageen sandwiches Bereid hepatocyte Culture medium (HCM). Voeg 15 μL glucagon (1 mg/mL), 15 μL hydrocortison (50 mg/mL) en 40 μL insuline (10 mg/mL) toe aan 50 mL van het volledige medium (DMEM, hoge glucose, 10% FBS, 1% penicileen-streptomycine). Gelijkmatig dispergeren 2 mL (5 x 105 cellen/ml) van levensvatbare primaire hepatocyten in een voorgecoate 3,5 cm schotel. Incubeer de cellen met 5% CO2 bij 37 °c gedurende 3 uur. belangrijk: Verdeel de cellen gelijkmatig door de schaal in alle richtingen te kantelen vlak voordat u het gerecht in een incubator zet. Bereid geneutraliseerde collageen I (100 μL/3.5 cm schaal; d.w.z. een voldoende volume voor alle gerechten zoals hierboven beschreven [stap 2,1]). Blijf op ijs tot gebruik. Verwijder na 3 uur voorzichtig de medium en niet-bevestigde cellen en voeg 100 μL geneutraliseerde collageen I toe aan elk 3,5 cm-gerecht om de toplaag van collageen sandwich op cellen te vormen. Inbroed de collageen sandwich onder de standaard celkweek condities (5% CO2 bij 37 °c) gedurende 1 uur. Voeg na een incubatie van 1 uur voorzichtig 2 mL HCM toe. Verander na 24 uur van cultuur het HCM-medium voor een nieuwe. Cultuur voor 3 – 8 dagen, afhankelijk van de vorming van gal canaliculi. Controleer de cultuur elke dag onder een microscoop (Figuur 4). Verander de HCM elke tweede dag. 7. immunolabeling van primaire hepatocyten in 3D collageen sandwiches Verwijder de media uit de sandwiches van hepatocyte en was voorzichtig met voorverwarmde PBS. Bevestig de sandwich culturen met 1 mL 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Na fixatie, was de broodjes 3x voor 10 min in 2 mL PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T). Permeabilize cellen met 1 mL 0,1 M glycine, 0,2% Triton X-100 in PBS bij RT voor 1 h. was 3x voor 10 min in PBS-T. De bovenste laag van collageen zachtjes verstoren met een 10 μL laadpunt dat is aangesloten op een vacuüm aspiratie om voldoende antilichaam penetratie te garanderen. Blok met 1 mL 5% BSA in PBS-T (d.w.z. blokkerende oplossing) voor 2 h. inbroed met primaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing ‘s nachts bij 37 °C. Was 3x gedurende 15 minuten in PBS-T. Na het wassen incuberen met secundair antilichaam bij 37 °C gedurende 5 uur. was 3x gedurende 15 minuten in PBS-T gevolgd door 1x wassen met gedistilleerd H2O. Monteer met anti-fade-bevestigingsmateriaal (Zie tabel met materialen) voor microscopie.