原原小鼠肝细胞的分离和3D胶原蛋白三明治培养，研究细胞骨架在胆汁形成中的作用

所有动物实验均按照欧洲指令2010/63/EU进行，并经捷克中央动物福利委员会批准。 1. 材料 根据实验室动物科学协会联合会的指导方针，在特定的无病原体条件下饲养动物，并免费获得常规的食肉和饮用水。在12小时/12小时的黑暗/光循环下饲养动物。对于肝细胞隔离和培养，使用8-12周大的动物。 库存解决方案 A 和 B 分别根据表1和表2准备库存溶液A和股票溶液B。将所有组件溶解在 1 L 的蒸馏 H2O （dH2O） 中。 将溶液的pH值调整到7.2，并通过0.2 μm过滤器过滤溶液。两种溶液可在4°C下储存长达6个月。 库存解决方案 C 在原发性肝细胞分离当天准备溶液C。 根据表 3添加所有组件，用 dH2O 填充到 50 mL 的总体积，然后溶解。将 pH 调整到 7.3。 在 50 mL 管中对 50 mL 溶液的等量。每只动物用一根管子。将所有必需的等分放入预热的水浴（37 °C）。 库存解决方案 D 在原发性肝细胞分离当天准备溶液D。 根据表 4将所有组件添加，用 dH2O 填充到 30 mL 的总体积，然后溶解。将 pH 调整到 7.3。 在 50 mL 管中对溶液的 30 mL 的等量。将胶原酶I（5mg/30 mL）加入溶液D.每只动物使用一个等分。将所有等分置于预热的水浴（37 °C）中。 库存解决方案 E 在原发性肝细胞分离当天准备溶液E。 根据表 5添加所有组件，用 dH2O 填充到 50 mL 的总体积，然后溶解。将 pH 调整到 7.3。 在 50 mL 管中对 50 mL 溶液的等量。在溶液 E 中加入白蛋白 V （0.65 g/50 mL）. 每只动物使用一个等分。将所有等分置于预热的水浴（37 °C）中。 2. 胶原蛋白三明治的制备 在原发性肝细胞分离的前一天，准备第一层胶原蛋白I三明治。注：在冰上工作，并使用预冷却溶液、吸头、板和管，以尽量减少胶原蛋白I不必要的凝胶化。 根据制造商的协议，中和所需量的胶原蛋白I（从大鼠尾部）。每个实验样品（3.5厘米盘）需要100μL的中和胶原蛋白（1.5mg/mL）。要制备1 mL的中和胶原蛋白（1.5毫克/升），加入100 μL的10x DMEM，1.5 μL的1M NaOH，48.5 μL的dH2O到500μL的胶原蛋白（库存浓度 = 3毫克/mL）。用石墨纸检查中和胶原蛋白的pH值（pH值应为+7.5）。 使用预冷冻的 200 μL 尖端均匀地分散 100 μL 的中和胶原蛋白溶液，在冰上设置的 3.5 厘米盘的表面。 在标准培养条件下孵育过夜（在37°C下孵化器，CO2为5%）。在原发性肝细胞分离当天，向第一个胶原蛋白层加入1 mL的预加热（37°C）PBS。在37°C下让胶原蛋白补水2-3小时。 3. 设备设置 准备材料表中列出的所有设备，并设置如图1所示。 4. 外科手术 通过肌肉注射瓷砖胺（60毫克/千克体重）、左拉西平（60毫克/千克）和木拉津（4.5毫克/千克）来麻醉小鼠。几分钟后，通过脚趾捏确认适当的麻醉。如果动物对挤压没有反应，则继续到4.2。 将麻醉鼠标放在解剖垫上，用胶带将下肢和上肢固定在固定位置。用 70% 乙醇擦拭腹部，用 V 形切口从到前腿打开腹部。将皮肤折叠到胸部以揭开腹腔。将解剖垫放在解剖显微镜下。 将胰岛素注射器针（30 G）弯曲至 45° 角。通过向牛腹方向移动肠道和结肠，露出劣质的vena卡瓦 （IVC）。 将 2.5 mL 的预加热 （37°C） 溶液 C 填充到带管状的 2 mL 注射器中。确保管状或注射器中没有气泡。 在IVC的开气之前，用湿 （PBS） 棉签将其压到隔膜上，重新定位肝叶。在肝脏正下方的IVC周围放置丝质缝合线（图2A，B）。 使用胰岛素注射器将10μL的肝素（5000 U/mL）注射到门户静脉中，30G针在45°角弯曲（图2C）。 要使肝脏分好，用显微手术剪刀对肝脏正旁边的IVC进行小切口（缝合线下方;图 2D）足够大，可插入导管。使用缝合线和两个手术结将管状固定在位置（图 2E）。 切开入口静脉 （图 2F） 使灌注缓冲液从肝脏流出，以防止肝脏扩张。 通过缓慢按下连接到管状的注射器（这应该需要±15 s），手动向肝脏注入1.5 mL的预加热溶液C。现在可以观察到肝脏通过变色从肝脏中去除血液。 用预加热 （37 °C） 溶液 C 预填充蠕动泵。 检查灌注装置，确保系统中没有气泡。 小心地将管从注射器上断开，并将其连接到以 2.5 mL/min 的流速运行的蠕动泵的管管上。 快速而小心地工作，确保管路保持到位，并且没有气泡进入管或管。 用溶液C给肝脏注入2分钟（溶液C的5 mL）。更改为溶液 D 并继续灌注 10 分钟（溶液 D 的 25 mL）。 一旦肝脏被注入，将其从腹腔中取出。肝脏现在非常脆弱，颜色苍白（图3）。 5. 原发性肝细胞的隔离 从鼠标中取出肝脏。管状仍然将绑在肝脏上，因此使用钳子将切口与肝脏解除，并小心地切断所有筋膜连接。将肝脏转移到含有20 mL预加热溶液E的50 mL管中。 用钳子与肝脏保持管状，通过摩擦管壁周围的肝脏来分离组织，将分离的肝细胞转移到缓冲液中。把孤立的细胞放在冰上。注：孤立的原发性肝细胞在冰上保存几个小时时是可行的。如有必要，用户可以重复步骤 4.1 到 5.2，从另一个供体小鼠中隔离初级肝细胞，或继续执行下一步。 将70μm尼龙细胞滤网放在50 mL管的顶部，并过滤分离的细胞。 将管在50 x g和4°C下离心5分钟。吸气上清液。要去除死细胞并增加活细胞的百分比，在 DMEM 中重新悬浮在 20 mL 的 40% 渗透中颗粒。 在50 x g和4°C下离心管5分钟。将含有死细胞的上清液吸气，并在20 mL溶液E中重新悬浮颗粒。 在50 x g和4°C下用离心管5分钟。吸气上清液，将颗粒重新悬浮在溶液E的10 mL中。 使用锥形蓝色染色检查主要肝细胞产量和生存能力。使用 Neubauer 细胞计数室计算细胞数，并将细胞浓度调整为 3.75 x 105个活细胞/mL。把细胞放在冰上 6. 3D胶原蛋白三明治中原发性肝细胞的培养 准备肝细胞培养基（HCM）。将15 μL的胰高血糖素（1毫克/升），15 μL的氢皮质酮（50毫克/升）和40μL的胰岛素（10毫克/mL）添加到50 mL的完整介质（DMEM，高葡萄糖，10S，1%青霉素-链霉素）。 在预涂的3.5厘米盘中均匀分散2 mL（5 x 105细胞/mL）的可行原发性肝细胞。在37°C下用5%的CO2孵育细胞3小时。 重要：在将培养皿放入培养箱之前，通过向各个方向倾斜，均匀地分配细胞。 准备中和胶原蛋白I（100μL/3.5厘米菜;即，按照上述[步骤2.1]）为所有菜肴提供足够的体积。保持冰上，直到使用。 3小时后，小心地取出中度和未连接的细胞，将100μL的中和胶原蛋白I加入每个3.5厘米的盘中，形成细胞上胶原蛋白三明治的顶层。在标准细胞培养条件下（37°C下5%CO2）孵育胶原蛋白三明治1小时。孵育1小时后，小心地加入2 mL的HCM。 培养 24 小时后，将 HCM 介质更改为新的介质。 培养3~8天，取决于胆汁的形成。每天在显微镜下检查文化（图4）。每隔一天更改一次 HCM。 7. 3D胶原蛋白三明治中原发性肝细胞的免疫标记 从肝细胞三明治中取出介质，然后用预热的PBS仔细清洗。在室温 （RT） 下，用 1 mL 的 4% 甲醛在 PBS 中固定三明治培养物 30 分钟。 固定后，在 PBS 的 2 mL + 0.1% 补间 20 （PBS-T） 中清洗三明治 3 次 10 分钟。 在PBS中，用1mL的0.1M甘氨酸，0.2%的Triton X-100在PBS中渗透细胞，在PBS-T中洗涤3次10分钟。 使用连接到真空吸气的 10 μL 加载尖端轻轻干扰胶原蛋白的顶层，以确保足够的抗体渗透。 在PBS-T中含有1mL 5%BSA的块（即阻断溶液）2小时。在37°C下用稀释的原抗体在阻断溶液中孵育一夜。在 PBS-T 中洗涤 3 次 15 分钟。 洗涤后，在37°C下孵育二级抗体5小时，在PBS-T中洗涤3次15分钟，然后用蒸馏H2O洗1次。 使用防褪色安装介质安装（参见材料表），用于显微镜。