Detta protokoll ger detaljerade experimentella steg för att upprätta en tredimensionell in vitro kultur av urinblåsan tumör organoider härrör från cancerframkallande-inducerad urinblåsan cancer. Kulturmetoder inklusive passaging, genteknik och orthotopic transplantation av tumör organoider beskrivs.
Utvecklingen av avancerade tumörmodeller har länge uppmuntrats eftersom nuvarande cancermodeller har visat begränsningar såsom brist på tredimensionell (3D) tumör arkitektur och låg relevans för mänsklig cancer. Forskare har nyligen utvecklat en 3D in vitro cancer modell som kallas tumör organoider som kan efterlikna egenskaperna hos en infödd tumör i en kultur skålen. Här beskrivs experimentella förfaranden i detalj för inrättandet av urinblåsan tumör organoider från en cancerframkallande-inducerad urinblåsan tumör, inklusive kultur, passage och underhåll av de resulterande 3D tumör organoider in vitro. Dessutom beskrivs protokoll för att manipulera de etablerade urinblåsan tumör organoid linjer för genteknik med lentivirus-medierad transduktion, inklusive optimerade villkor för effektiv införande av nya genetiska element i tumör organoider. Slutligen läggs förfarandet för ortotopic transplantation av urinblåsan tumör organoider i väggen i urinblåsan för ytterligare analys. De metoder som beskrivs i denna artikel kan underlätta inrättandet av en in vitro-modell för cancer i urinblåsan för utveckling av bättre terapeutiska alternativ.
Urinblåsan cancer är den vanligaste urinvägscancer, med cirka 165.000 patienter dör årligen1. Bland de olika typerna av cancer i urinblåsan, muskel-invasivurothelial carcinom uppvisar en aggressiv fenotyp, och dess 5 år överlevnad är lägre än 50%2. Nya terapeutiska alternativ för invasiva urothelial tumörer har inte utökats under de senaste decennierna1.
Cancer cellinjer har använts i stor utsträckning för läkemedelsscreening3. Även om gynnsamma resultat har observerats i många läkemedelskandidater i cancer cellinjer, dåliga resultat rapporteras i kliniska prövningar4. Efter ökad anpassning till in vitro tvådimensionella (2D) kulturmiljöer, har det blivit allt svårare att sammanfatta inhemska tumörer i cellinjer. Djurcancer modeller eller patient-härledda tumör xenografts kan användas för att ta itu med de begränsningar som observerats i blåscancer cellinjer. Djurcancermodeller är dock tids- och resursintensiva. Därför har förbättrade sjukdomsmodeller varit efterfrågade i flera år och ett nytt modellsystem, organoider, har utvecklats för att övervinna bristerna i befintliga modeller5.
En organoid är en multicellulär 3D-konstruktion som kan sammanfatta in vitro de fysiologiska egenskaperna hos dess motsvarande in vivo organ. Normala och tumör organoider kan härledas från antingen pluripotenta eller vuxna stamceller, och primära tumörceller, respektive5,6. Under de senaste åren har tumör organoider fastställts från ett stort antal olika tumörvävnader7, inklusive kolon8,9, urinblåsan10, bukspottkörtel1,12, prostata13, lever14och bröst15 tumörvävnader. Sådana tumör organoider efterlikna deras ursprungliga tumörer fenotypiskt och genetiskt. På grund av deras likhet med in vivo tumörvävnader och deras många praktiska tillämpningar, forskare har antagit dem som nya sjukdomsmodeller i studien av cancer patogenes.
Här läggs förfarandena för inrättandet av tumörorganoider från en cancerframkallande murin invasiv urothelial tumör16 ut. N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin (BBN) används som cancerframkallande för att inducera invasiva urothelial carcinom hos möss17 och tumör organoider, som uppvisar patologiska egenskaper mus muskel-invasiva urinblåsan tumörer, är etablerade från BBN-inducerad urinblåsan cancer16. Metoden för att genetiskt manipulera tumörorganoider illustreras med lentivirusmedierad transduktion för att utveckla ett modellsystem för att studera den molekylära grunden för utvecklingen av cancer i urinblåsan. Dessutom beskrivs en metod för transplantation av organoider ortotopiskt i en blåsa för att undersöka den inhemska urinblåsans roll i urinblåsan cancer.
Detta protokoll beskriver experimentella förfaranden för att odla och upprätthålla urinblåsan tumör organoider härrör från cancerframkallande murine urinblåsan tumörer.
I det här protokollet finns det flera experimentella steg där procedurerna kan behöva viss felsökning. För det första är antalet tumörceller som ursprungligen sådd en kritisk faktor eftersom lågt antal tumörceller i kulturen (<2 x 104 celler) främst leder till celldöd på grund av brist på interaktioner mellan tumörceller. Däremot leder början med för många celler (>5 x 104 celler) vid sådd till överfulla organoider, vilket resulterar i svårigheter vid hantering av kulturer med dålig tillväxt av varje organoid. Det föreslås starkt att flera plattor med olika antal celler etableras i början för att optimera de experimentella förhållandena. Identifiera rätt antal inledande tumörceller är avgörande för att uppnå den högsta cellen lönsamhet och att fastställa framgångsrika urinblåsan tumör organoider. Också, i långsiktig kultur över 2 veckor utan passaging, de flesta tumör organoider sluta växa, potentiellt på grund av otillräcklig tillgång på näringsämnen i mitten av organoider och utarmning av tillväxtfaktor i källaren membran matris. Därför subculturing organoider i tid är ett kritiskt steg för att upprätthålla tumör organoid kultur.
För det andra är produktionen av högtiter lentivirala partiklar avgörande för effektiv genetisk manipulation av tumör organoider. För att felsöka virustiter-relaterade problem, det är starkt föreslås att viruset titers bestämmas före viral transduktion varje gång eftersom lentiviralkonstruktioner tenderar att producera viruspartiklar med varierande effektivitet. Om tumör organoider uppvisar låg lönsamhet efter virusinfektion, Är det troligt att virustiters är potentiellt för hög. Det föreslås starkt att använda lägre mängd virus i detta fall. För det tredje, under orthotopic transplantation av BBN-inducerad urinblåsan tumör organoider, Är det viktigt att upprätthålla integriteten hos urinblåsan väggen. Om injektionen når blåsans lumen genom att tränga in i blåsväggsskiktet, ska experimentet avslutas och kasseras. Om möjligt rekommenderas övervakning av urinblåsan tumörtillväxt med hjälp av ett ultraljudsavbildningssystem.
En begränsning av de nuvarande teknikerna är frånvaron av tumörmikromiljön eller stroma i dessa organoider. För att övervinna denna fråga, Det är starkt föreslagit att ortotopic transplantation av tumör organoider använda ett in vivo-system för att efterlikna den inhemska tumör mikromiljön. I framtiden kommer det att bli nödvändigt att utveckla 3D in vitro organoidsystem som består av tumör organoider med andra komponenter i tumör stroma.
En av de största konsekvenserna av vår teknik är att i ortotopic transplantation av tumör organoider, endast 10 urinblåsan tumör organoider kan inducera tumörtillväxt i urinblåsan. Jämfört med de konventionella tumörtransplantationexperiment som kräver 5 x 105–1 x 106 enstaka tumörceller i urinblåsan är våra metoder mycket effektivare och robustare. En annan betydande skillnad är att organoiderna kan manipuleras mångsidigt med hjälp av olika lentivirala vektorer, såsom lentivirala konstruktioner som innehåller korthårsnål RNA, CRISPR-Cas9-systemet eller gener av intresse. Dessa skulle vara kraftfulla verktyg för att lägga till nuvarande organoid teknik. Sammantaget kan de experimentella metoder som presenteras här underlätta inrättandet av in vitro tumör modeller som kan förbättra vår förståelse av patogenesen vid cancer i urinblåsan snarare än att använda 2D-blåscancer cellinjer.
Denna metod kunde fastställa urinblåsan tumör organoider härrör från en cancerframkallande-inducerad urinblåsan tumör. Artikeln ger en beskrivning av lentivirus-medierad experimentella förfaranden genom vilka de genetiska modifieringarna införs och stabilt upprätthålls i urinblåsan tumör organoider. Dessutom ingår ett förfarande för ortotopic transplantation av tumör organoider. I kombination med nuvarande in vivo cancermodeller, denna teknik kommer att vara ett användbart verktyg för att studera den molekylära grunden för urinblåsan tumorigenesis.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av bidrag från Koreas nationella forskningsstiftelse till KS: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y060) BK21 Plus Research Fellowship.
0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
24-well plate | Corning | 3526 | |
29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
Cyrovial | Corning | 430488 | |
DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
Razor blade | |||
Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |