Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

1. Hücre kültürü Uygun bir kültür medyailgi Kültür hücreleri. Kontaminasyonu önlemek için penisilin-streptomisin eklenebilir. HepG2 hücrelerinde, Dulbecco’nun modifiye Eagle’s medium (DMEM) içeren bir kültür medya kültür hücreleri% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmektedir (FBS) ve 0.1% penisilin-streptomisin. Raman spektroskopisi ölçümlerini kolaylaştırmak için hücreler %0,1 jelatin kaplı cam alt çanak veya kuvars slaytlarda yetiştirilebilir. 37 °C’de 2 gün, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO2’de kuluçkaya yatırın. Hücre kültürlerini senkronize edin ve ‘lik bir araya ulaşın. 35 mm’lik cam dipızgara çanağına veya aynı ortayı kullanarak 0,7 x 106’lıkbir tohumlama yoğunluğuna giren kuvars slaytlarına alt kültür hücreleri, daha sonra 37 °C’de 24 saat kuluçkaya yatırın.NOT: Kültür yemekleri veya slaytlar, ölçüm sırasında hayatta kalmalarını sağlayarak, 5 ug/cm2 kültür yüzeyi oranı ile kollajen veya jelatin kaplama çözeltisi ile önceden kaplanabilir. 2. İlaç tedavisi Hücre kültürlerini kuvözden çıkarın ve önceden ısıtılmış PBS tamponu (37 °C) ile 2 kat yıkayın.NOT: İlaç tedavisi için hücreleri -60 arasında bir kesişme ile çıkarmak en uygun uyrmaktadır. Hücreleri 35 mm kültür yemeklerinde ilaçla tedavi edilen ve tedavi edilmeyen alt gruplara ayırın. Seçtiğiniz ilacı kültür medyasıyla karıştırın. Örneğin, dimethyl sulfoxide (DMSO) tamoksifen çözünve kültür medya ile karıştırın 2 mL ve 10 μM tamoksifen konsantrasyonu son bir hacim elde etmek için. Bu uyuşturucu tedavisi gören grup olacak. DMSO’nun etkilerini incelemek için ilgili hacimde (DMSO) bir kontrol olarak ortama karıştırın. Bu kontrol grubu olacak. 2.3-2.4 adımlarında hazırlanan sivri uçlu ortamın 2 mL’sinde her iki grubu da 24 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonrası beklenen kesişme -80 olmalıdır. 3. Raman spektral görüntüleme ve spektral işleme NOT: Raman spektroskopi sistemleri ticari olarak mevcut olmasına rağmen, burada kullanılan Raman spektroskopi sistemi daha önce7,8açıklanan bir ev yapımı hat tarama confokal mikroskop olduğunu. Kısaca, bu sistem 532 nm diyot pompalı katı hal lazer ile donatılmıştır. Lazer ışığı, tek bir pozlamada 400 spektrumölçümü sağlayan silindirik bir lens kullanılarak düzleme dönüşür. Raman spektrumları, parmak izi bölgesinin spektral çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için 1.200 oluk/mm ızgara kullanan bir polikromatörün üzerine monte edilmiş soğutulmuş ccd kamera kullanılarak kaydedildi (500-1.800 cm-1). Bu spektral alan Raman saçılımı üreten moleküllere özgü frekansların yüksek yoğunluklu içerir. Su daldırma objektifi (NA = 0.95) de kullanılır. Bu sistemin mekansal çözünürlüğü ~300 nm ve spektral çözünürlük 1 cm-1’dir. Deney sırasında hücre hayatta kalmasını sağlamak için motorlu mikroskop aşamasına sabitlenmiş bir mikrohazettir. Spektral ölçümlerden önce, optiklerin hizalanmasını doğrulayın. İğne deliği ve lazer pozisyonunun tam olarak eşleşip eşleşmediğini doğrulamak için 50 μm’lik bir iğne deliği kullanılabilir. Mümkün olduğunca daraltıldığında spektrofotometre yarık girin. Her deneyden önce spektrofotometreyi kalibre etmek için etanol kullanın. Bunu yapmak için, bir cam alt çanak EtOH yerleştirin, belirli bir lazer yoğunluğunda spektrum ölçmek (örnek olarak ölçülen) için 1 s, ve bilinen dalga boyları için tepe ilişkilendirmek7. Örneklerdeki lazer yoğunluğunu ~2,4 mW/μm2’ye indirin, böylece hücreler lazer maruziyetinden sağ çıkabilsin. Mikro hazneyi %5 CO2 ve 37 °C’de ayarlayın. Mikroskop sistemi hazır olduğunda, hücreleri kuvözden çıkarın ve hücreleri ısıtılmış PBS (37 °C) tamponla 2 kat durulayın, ardından hücreleri askıya almak için 2 mL ısıtılmış PBS (37 °C) veya DMEM ekleyin.NOTLAR: Hem PBS hem de FloroBritd DMEM tabanlı ortam raman spektroskopi ölçümleri için yeterli seçeneklerdir çünkü en az arka plan sinyali üretirler. Su daldırma objektif in üzerine 10 μL su ekleyin ve cam alt hücre çanamasını mikroskop aşamasına hassas bir şekilde yerleştirin. Lazer çizgisini odaklayarak her hücreyi ölçün. Hücre başına 15 s maruz kalma süresi burada net raman sinyali olan bir hücrenin kesitini elde etmek için yeterlidir. Bir galvano ayna birkaç düzine dakika içinde bir hücre veya hücre grubu tarama sağlar.NOTLAR: Hücrelerin tam spektral görüntüleme yüksek çözünürlük daha fazla zaman gerektirir ve fotohasara yol açabilir. Burada, hücreler her hücrenin bir kesitelde etmek için tek satırlık pozlama kullanılarak ölçüldü. Bu yaklaşım, iş bünyesini artırmak ve hücreleri ayırt etmek için yeterli bilgi elde etmek için iyi bir denge dir. Ayrıca fotohasarı sınırlayarak hücre canlılığını da sağlar. 4. Spektral verilerin ön işlenmesi ve çok değişkenli analizler NOT: Ön işleme, spektral verilerdeki istenmeyen teknik varyasyonları kaldırmak için ek analizden önce gerekli bir adımdır. Yöntem ve yazılım çeşitliliği nedeniyle, ayrıntılı bir liste sağlanamaz ve literatürde bulunan birçok yararlı değerlendirmeleri vardır7,8. Bu bölümde, yaşayan tek hücrelerden elde edilen spektral Raman verilerini analiz etmek ve yorumlamak için kullanılan yaklaşımı kısaca açıklıyoruz. Olası kozmik ışın parazitini ortadan kaldırmak için Raman görüntülerini ayıklayın ve önceden işlemeyapın.NOT: Farklı gün/hafta/aylarda elde edilen spektrumların spektral ekseni, etanol kullanılarak kalibrasyon sırasında ki küçük teknik varyasyonlar nedeniyle bazı varyasyonlar içerebilir. Bu, sonraki çok değişkenli analizleri ve istatistiksel karşılaştırmaları güçlü bir şekilde etkileyecektir. Deneylerin farklı haftalar/aylarda yapılması durumunda, küçük optik varyasyonlar beklenmektedir. Bu durumda, verilerin deneyler arasında nihai spektral kaymaları için düzeltmek için veriler enterpolasyonlu olmalıdır. Burada kübik spline kullanarak enterpolasyon kullanılır. Bu adımdan sonra, tüm spektrum ekseni hizalanmalıdır. Sonraki analizler için 500-1.800 cm-1 aralığı dikkate alınr. Ev yapımı bir algoritma kullanarak her görüntüden hücrelerin ve arka planın (hücrelerin yokluğu) spektral verilerini ayıklayın. Hücrenin sinyalinden arka plan sinyalini çıkarın. Daha sonra, tek bir hücreye karşılık gelecek kalan piksellerin spektrumlarının ortalamasını alamalısınız. Aşağıdaki adımlar hücrelerin 2B spektrumları kullanılarak gerçekleştirilir. ModPoly9’u veya yeterince sığacağını tahmin ettiği başka bir algoritmayı kullanarak temel düzeltme gerçekleştirin. Parmak izi bölgesini seçmek ve kötü polinom takılması nedeniyle spektrumüzerinde istenmeyen kenar efektleri olmadığından emin olmak için spektral aralığı 600-1.700 cm-1’e belirleyin. Diğer normalleştirmeler düşünülebilir rağmen, spektral yoğunluğu10normalleştirmek için vektör normalleştirme (her dalga numarasındaki yoğunluk küresel l2 norm veya bir spektrumun maksimum tekil değeri ile bölünür) gibi bir normalleştirme adımı gerçekleştirin. Her sınıf/koşul için uygun etikete sahip bir veri kümesi hazırlayın.NOT: Karşılaştırmalı spektral analizler hücre sınıfı/koşulları arasındaki olası farklılıkların doğasını araştırmak için perfored edilebilir (örneğin, kontrol grubunun ortalama spektrumunu diğer gruplara çıkararak ilgi bölgelerini (potansiyel biyobelirteçler gibi) belirleyebilir). ANOVA ve Fisher puanları hesaplamaları da10yapılabilir. Spektral özelliklere göre tedavi edilen ve işlenmemiş hücreleri belirlemek için çok değişkenli analizler uygulanabilir. Normalleştirilmiş spektral veriler bir eğitim veri kümesi olarak kullanılmalı ve mümkünse çoğaltma deneyinden bilinmeyen bir veri kümesi (etiketsiz) test verisi olarak kullanılmalıdır.NOT: Bir temel bileşen analizinin bazı vektörü (PCA-DA10),gizli skorlar üzerinde projeksiyon ve ardından ayrımcı analiz (PLS-DA) ve destek vektör makineleri (SVM)11’in bazı vektörleri üzerinde yapılan ayrımcı analiz, genellikle alanında kullanılan modellerdir ve her biri farklı istatistiksel hususlar sunar. Sonuç olarak verilerin ön işlenmesi yapılmalıdır. Deneysel hedeflere uygun makine öğrenimi kullanın. Burada, gizli yapı (PLS) modeli üzerinde bir projeksiyon Raman spektrum (600-1.710 cm-1)11,12spektral parmak izi bölgesi kullanılarak inşa edilmiştir. Verileri gerektiği gibi ortala. Modelin çapraz geçerliliği için farklı teknikler uygulanabilir.NOT: Burada 10 bölmeli venedik kör çapraz doğrulama uygulanmaktadır. Model karmaşıklığı (bileşen sayısı veya gizli değişken) en iyi modelkök ortalama hata (RMSE) değerini en aza indirir, böylece sınanmalıdır. Bu üç gizli vektörler (LVs) bizim veri seti ile en iyi ayrımcılık sağlanan bulundu. Raman spektral zirvelerinin hücrelerin ayrımcılığa katkısı olduğunu belirleyin (örneğin, her Raman dalga sayısı veya regresyon katsayısının büyüklüğü için projeksiyonda [VIP] değişken öneme sahip puanı çizerek).NOTLAR: Bir değişkenin VIP skoru, PLS-DA bileşenleri ile özgün değişken arasındaki kareli korelasyonların ağırlıklı toplamı olarak hesaplanır. PLS ve VIP puanları algoritması ile ilgili ayrıntılar literatürde bulunabilir11,12. 5. Tek hücreli örnekleme kurulumu ve prosedürleri Hücre örnekleme sistemini Şekil 1’degösterildiği gibi Raman mikroskobuna sabitle. Negatif basınç uygulayarak numune emme için boş bir şırınga bağlı cam kılcal tutucu 3D micromanipulator bağlayın (Şekil 1). Mikroskobu, cam kılcal damarın ucunu gözlemlemek ve kırılmadığından emin olmak için yüksek bir büyütme alanına (40x) ayarlayın. Mikromanipülatör (x-, y-, z-eksenleri) kullanarak cam kılcal damarın konumunu kontrol edin. Kılcal uç görüş alanında ortalanmış olduğundan emin olun, sonra daha sonra kültür çanak için açıklık vermek için z ekseni üzerinde kılcal yukarı taşıyın.NOT: Hücrelerin mikro örneklemesi, çapları 10-15 m arasında olan hücreler için cam kılcal damar ile yapılır. ~5 μm delik boyutunda bir kılcal damar önerilir. Delik boyutu çok küçükse, kılcal uç hücre tarafından takılır ve çok büyükse, daha sonraki MS ölçümlerinin hassasiyeti tehlikeye girer. Örnek plakayı/kabı nı mikroskop un sahnesine yerleştirin, büyütme ve odaklamayı ayarlayın, ızgara çanağı üzerindeki hedef hücreyi seçin ve görüş merkezine taşıyın. Daha sonra, ucu odak haline gelene kadar mikromanipülatör (z-ekseni) kullanarak cam kılcal aşağı dikkatle aşağı indirin.NOT: Kılcal damar odak noktası olana kadar x ve y eksenlerinde kılcal damarı hareket ettirmemeye dikkat edin. Mikroskobik gözlem altında, kılcal ucu ile hedef tek hücredokunun, sonra kılcal ucu içinde hücre tuzak şırınga kullanarak negatif basınç uygulamaya başlar. Gerekirse hücrenin zamanlamasını ve emilmiş konumunu tam olarak kontrol etmek için bir fotoğraf veya video çekerek bu yordamı kaydedin. Kılcal damarı z ekseninde yukarı doğru hareket ettirin. Daha sonra, MS analizine hazırlık olarak forseps kullanarak kılcal damar tutucudan kılcal damarı ayırın. 6. Kütle spektrometresi ölçümleri MS cihazının kütle doğruluğunu üreticinin tavsiyelerine göre kalibre edin. Kalibrasyondan sonra, kütle hatasının dakikada 3 ppm’den büyük olmadığından emin olun. MS cihazını ilgi analizi için en uygun parametrelere optimize edin.NOT: Tamoksifen ve 4-OHT analizi nde alet parametreleri aşağıdaki lere ayarlanır: giriş kılcal damar sıcaklığı: 400 °C, püskürtme gerilimi: 1500 V, otomatik kazanç kontrol hedefi (AGC): 5.00E+06, S-lens RF seviyesi: , SIM aralığı: 347-397 m/z, SIM maksimum enjeksiyon süresi: 200 ms, SIM çözünürlük: 140.000 FWHM, MS/MS aralığı: 50-400 m/z, MS/MS AGC hedefi: 2.00E+05, MS/MS maksimum enjeksiyon süresi: 100 ms, MS/MS çözünürlüğü: 17.500 FWHM, MS/MS izolasyon penceresi: 1 m/z, MS/MS normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE5). Göreceli nicelik elde etmek için SIM modu için 5 dk süreli otomatik bir kazanım yöntemi ve ilacın ve metabolitinin pozitif tanımlanması için başka bir MS/MS yöntemi ayarlayın. Edinme yönteminin parametreleri adım 6.2’de belirtilen en iyi duruma getirilmiş değerlere ayarlanmalıdır. Bir duman başlık altında iyonizasyon çözücü hazırlayın. Çözücü bileşimi ilgi analizine bağlıdır. Burada kullanılan organik çözücü MeOH, DMSO ve %0.1 formik asitten oluşmaktadır. Ölçümlerden önce uygun bir iç standardı organik çözücüile karıştırın. Bu deneyde, 5.31 nM d5-tamoksifen iç standart olarak kullanılır. Yanlış pozitifleri önlemek için, herhangi bir hücresel parça örnekleme önlemek için sürekli mikroskobik gözlem ile 1 μm delik boyutunda kılcal kullanarak ilaç ile tedavi hücreleri çevreleyen medya aspire. Yükleyici uçlarına bağlı bir pipet kullanarak ortam içeren kılcal damarın geniş ucuna 2 μL iyonizasyon çözücüekleyin. Daha sonra, MS tarafından örneklenmiş ortam analiz, ilgi analyt varlığını kontrol edin (normalde, tespit edilmemelidir). Hücreyi içeren kılcal damara 2 μL iyonizasyon çözücüsi ekleyin, kapilleri uygun bir kütle spektrometresine bağlı bir nanoelektrosprey adaptörüne (nano-ESI) sabitlayın ve otomatik satın alma yöntemini başlatın. 7. Kütle spektrometresi veri işleme ve analizi NOT: Veri analizi yapmak için uygun herhangi bir yazılım kullanılabilir. Ancak, araştırmacılar MS satıcısı tarafından sağlanmayan bir yazılım kullanarak veri analizi yapmak istiyorlarsa, ham veriler özel satıcı biçiminden açık bir biçime veya önce bir metin dosyası olarak dönüştürülmelidir (burada yapıldı). İlgi analyt(ler)’in en yüksek alanını aynı MS tetkisinden iç standardına bölerek verileri normalleştirin. Ardından, çarpıklığı azaltmak için tepe oranlarını dönüştüren günlük defteri. Tek hücreler arasındaki dağılımı görselleştirmek için ilacın veya metabolitinin normalleştirilmiş yoğunluğunu bir kutu çizimi veya yoğunluk eğrisi olarak çizin. Burada, R istatistik yazılımı ggplot2 paketi ile birlikte kullanılır. Metabolize edilen ilacı, her hücredeki metabolize edilmemiş ana molekülün (yani 4-OHT ve tamoksifen) ile bölünerek, ilaç metaboliti nin bolluğunu metabolize edilmemiş ilaç oranına göre hesaplayın.NOT: Belirli Raman ilgi zirvelerinin varyasyonları ile ilacın MS zirveleri veya metabolitleri arasındaki ilişki incelenebilir. Bu tek hücrelerde ilacın kendisi ve metaboliti arasındaki olası korelasyon bir ektir. Bu iki kuyruklu test kullanılarak Pearson korelasyon katsayısı hesaplanarak yapılabilir. Daha gelişmiş bütünleştirici yaklaşımlar da göz önünde bulundurulmalıdır.