単細胞薬の取り込み、代謝、および効果を研究するための統合ラマン分光法と質量分析プラットフォーム

1. 細胞培養 適切な培養媒体に目的とする培養細胞。ペニシリン・ストレプトマイシンは、汚染を避けるために添加され得る。HepG2細胞の場合、10%ウシウシ血清(FBS)および0.1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)を含む培養培地中の培養細胞。ラマン分光測定をファシリティするために、細胞は0.1%ゼラチンコーティングガラス底皿または石英スライドで成長させることができる。 加湿インキュベーターで細胞を37°Cで2日間、5%CO2でインキュベートします。 細胞培養物を同期して70%の合流性に達します。 細胞を35mmガラス底グリッド皿にサブカルチャーし、同じ培地を使用して0.7 x 106の播種密度でスライドし、その後37°Cで24時間インキュベートします。注:培養皿やスライドは、コラーゲンまたはゼラチンコーティング溶液を5 ug/cm2の培養表面比で事前にコーティングし、測定中の生存を保証します。 2. 薬物治療 インキュベーターから細胞培養物を取り出し、前温PBS緩衝液(37°)で2x洗浄します。注:50%-60%のコンフルエントで薬物治療のための細胞を除去することは最適です。 35 mmの培養皿で細胞を薬物処理および未処理のサブグループに分割します。 選択した薬物を培養媒体と混合する。例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)にタモキシフェンを溶解し、培養媒体と混合して、2mLの最終体積と10μMのタモキシフェン濃度を得た。これは薬物処理されたグループになります。 対応する溶媒(DMSO)をコントロールとして培地に混ぜ、DMSOの効果を調べるようにします。これが制御グループになります。 ステップ2.3~2.4で24時間作成したスパイクメディアの両方のグループを2mLでインキュベートします。インキュベーション後の予想される合流率は70%-80%でなければなりません。 3. ラマンスペクトルイメージングとスペクトル処理 注:ラマン分光システムは市販されていますが、ここで使用されるラマン分光システムは、前述の7、8で説明した家庭用ライン走査共焦点顕微鏡です。簡単に言えば、このシステムは532 nmダイオードポンプソリッドステートレーザーが装備されています。レーザー光は円筒レンズを使用して平面に形成され、1回の露光で400スペクトルの測定が可能です。ラマンスペクトルは、指紋領域のスペクトル分解能を最大化するために1,200の溝/mmグレーティングを使用するポリクロメータに取り付けられた冷却されたCCDカメラを使用して記録されました(500-1,800 cm-1から)。このスペクトル領域には、ラマン散乱を発生させる分子に特異的な周波数の高密度が含まれています。水浸物レンズ(NA = 0.95)も使用します。このシステムの空間分解能は~300nmで、スペクトル分解能は1cm-1です。実験中に細胞の生存を確実にするために、電動顕微鏡ステージに固定されたマイクロチャンバーが使用される。 スペクトル測定の前に、光学系の位置合わせを確認します。50 μm のピンホールを使用して、ピンホールとレーザー位置が正確に一致することを確認できます。できるだけ狭くした場合は、分光光度計のスリットを入力します。 各実験の前に分光光度計を校正するためにエタノールを使用してください。これを行うには、EtOHをガラス底皿に入れ、所定のレーザー強度(サンプルで測定)でスペクトルを1s測定し、ピークを既知の波長7に関連付ける。 サンプルのレーザー強度を~2.4 mW/μm2に最小化し、細胞がレーザー露光を生き残るようにします。 マイクロチャンバーを5%CO2および37°Cに設定します。 顕微鏡システムの準備ができたら、インキュベーターから細胞を取り出し、すぐに加温されたPBS(37°)緩衝液で細胞2xをすすいでから、2mLの加温PBS(37°C)またはDMEMを加えて細胞を再中断します。注:PBSとフルオロブライトDMEMベースのメディアは、最小限のバックグラウンド信号を生成するため、ラマン分光測定に十分なオプションです。 水浸度の対物レンズに10μLの水を加え、ガラス底の細胞皿を顕微鏡の段階に繊細に置きます。 レーザーラインに焦点を合わせて各セルを測定します。セル当たり15sの露光時間は、明確なラマン信号を有する細胞の断面を得るのに十分である。ガルバノミラーは、数十分以内に1つの細胞または細胞のグループをスキャンすることができます。注:細胞の完全なスペクトルイメージングの高分解能は、より多くの時間を必要とし、光の損傷につながる可能性があります。ここで、細胞は単一線露光を用いて測定し、各細胞の断面を得た。このアプローチは、スループットを向上させ、細胞を判別するのに十分な情報を得るだけでなく、光ダメージを制限することによって細胞の生存率を確保するための良いトレードオフです。 4. スペクトルデータの前処理と多変量解析 注: 前処理は、スペクトル データ内の不要な技術的なバリエーションを削除するために、追加の分析の前に必要な手順です。メソッドとソフトウェアの多様性のために、網羅的なリストを提供することはできませんし、文献7、8に見られる多くの有用なレビューがあります。このセクションでは、生きている単一細胞から得られたスペクトルラマンデータの解析と解釈に使用されるアプローチについて簡単に説明します。 ラマン画像を抽出して前処理し、可能な宇宙線干渉を除去します。注:異なる日/週/月の間に得られたスペクトルのスペクトル軸は、エタノールを使用したキャリブレーション中の小さな技術的なバリエーションに起因するいくつかのバリエーションを含む場合があります。これは、後続の多変量解析と統計比較に強く影響します。実験が異なる週/月の間に行われる場合には、小さな光学的変動が予想されます。この場合、実験間のデータの最終的なスペクトルシフトを修正するために、データを補間する必要があります。ここでは、3 次スプラインを使用した補間を使用します。このステップの後、すべてのスペクトル軸を位置合わせする必要があります。500-1,800 cm-1の範囲は、後続の分析のために考慮されます。 自家製アルゴリズムを使用して、各画像から細胞と背景(細胞の不在)のスペクトルデータを抽出します。セルの信号からバックグラウンド信号を差し引きます。次に、残りのピクセルのスペクトルを平均化し、これは単一のセルに対応する必要があります。次の手順は、セルの 2D スペクトルを使用して実行されます。 ModPoly9または十分に適合すると推定されるその他のアルゴリズムを使用してベースライン補正を実行します。スペクトル範囲を 600 ~1,700 cm-1にトリムして指紋領域を選択し、多項式フィッティングが不良によるスペクトルに不要なエッジ効果がないことを確認します。 ベクトル正規化(各波数の強度をグローバルl2ノルムまたはスペクトルの最大単数値で除算)などの正規化ステップを実行してスペクトル強度10を正規化するが、他の正規化は考えられる。 クラス/条件ごとに適切なラベルを持つデータセットを準備します。注:比較スペクトル分析は、細胞クラス/条件間の可能な相違の性質を探索するために穿極することができる(例えば、対照群の平均スペクトルを他のグループに差し引いて、目的の領域(潜在的バイオマーカーなど)を特定する)。ANOVAとフィッシャースコアの計算も10を実行することができます。 スペクトルフィーチャに基づいて処理されたセルと未処理のセルを識別するために、多変量解析を適用できます。正規化されたスペクトル データはトレーニング データセットとして使用し、可能であれば、反復実験の不明なデータセット (ラベルなし) をテスト データとして使用する必要があります。注:主成分分析(PCA-DA10)の一部のベクトルに対して実行される判別分析、潜在スコアの投影、判別分析(PLS-DA)、およびサポートベクターマシン(SVM)11は、フィールドで頻繁に使用されるモデルであり、それぞれが異なる統計的考慮事項を提示します。その結果、データの前処理を実行する必要があります。 実験目的に合った機械学習を使用します。ここで、潜在構造(PLS)モデル上の投影は、ラマンスペクトル(600-1,710 cm-1)11、12のスペクトル指紋領域を用いて構築される。必要に応じてデータを平均的に中央に配置します。モデルのクロス検証には、さまざまな手法を適用できます。注: ここでは、10 個の分割を持つベネチアブラインドクロス検証が適用されます。最適なモデルが二乗平均平方根誤差 (RMSE) 値を最小限に抑えるように、モデルの複雑さ (コンポーネントの数または潜在変数) をテストする必要があります。3 つの潜在ベクター (RV) がデータセットで最良の判別を提供していることがわかりました。 どのラマンスペクトルピークが細胞の判別に寄与しているかを特定します(例えば、各ラマン波数または回帰係数の大きさについて、投影[VIP]における可変的な重要度のスコアをプロットすることによって)。注: 変数の VIP スコアは、PLS-DA 成分と元の変数の間の平方相関の加重合計として計算されます。PLSおよびVIPスコアアルゴリズムに関する詳細は、文献11、12で見つけることができます。 5. 単一セルサンプリングのセットアップと手順 図 1に示すように、セルサンプリング システムをラマン顕微鏡に固定します。3Dマイクロマニピュレータを、負圧を加えることでサンプル吸引用の空のシリンジに取り付けられているガラスキャピラリーホルダーに接続します(図1)。 顕微鏡を高倍率(40x)に設定して、ガラスキャピラリーの先端を観察し、壊れないことを確認します。マイクロマニピュレータ(x、Y、Z軸)を使用してガラスキャピラリーの位置を制御します。毛細血管先端が視野の中央にあることを確認し、後で培養皿のクリアランスを与えるために、毛細血管をZ軸上に上に移動させます。注:細胞のマイクロサンプリングは、直径が10〜15μmの細胞に対してガラスキャピラリーによって行われます。ボアサイズが~5μmの毛細血管をお勧めします。ボアサイズが小さすぎると、キャピラリー先端がセルに差し込まれ、大きすぎると、後のMS測定の感度が損なわれる可能性があります。 顕微鏡のステージにサンプルプレート/皿を置き、倍率と焦点を調整し、グリッド皿上のターゲットセルを選択し、視野の中央に移動します。次に、マイクロマニピュレータ(Z軸)を使用してガラスキャピラリーを慎重に下げて、先端が焦点を合わせます。注: 毛細血管に焦点が合うまで、X 軸と Y 軸の毛柱を移動しないようにしてください。 顕微鏡観察の下で、キャピラリー先端でターゲット単一セルに触れ、シリンジを使用して負圧を加え始め、キャピラリー先端の内側に細胞をトラップします。必要に応じて、セルのタイミングと吸引位置を正確に確認するために写真やビデオを撮ることによって、この手順を記録します。 毛細血管を Z 軸上で上に移動します。次いで、MS分析の準備として鉗子を使用して毛細血管ホルダーから毛細血管を取り外す。 6. 質量分析測定 メーカーの推奨事項に従って、MS計測器の質量精度を調整します。キャリブレーション後、質量誤差が3ppm以下であることを確認します。 MS インストゥルメントを、対象の検語に最適なパラメータに最適化します。注:タモキシフェンおよび4-OHT分析の場合、計器パラメータは次のように設定されています:入口キャピラリー温度:400°C、噴霧電圧:1500V、自動ゲイン制御ターゲット(AGC):5.00E+06、SレンズRFレベル:90%、SIM範囲:347-397 m/z、z、次に設定されます。 SIM 最大射出時間: 200 ミリ秒、SIM 解像度: 140,000 FWHM、MS/MS 範囲: 50-400 m/z、MS/MS AGC ターゲット: 2.00E+05、MS/MS 最大射出時間: 100 ミリ秒、MS/MS 解像度: 17,500 FWHM、MS/MS 分離ウィンドウ: 1 m/z、MS/MS 相対的な定量を達成するためにSIMモードの期間を5分の自動取得方法と、薬物とその代謝物の正の同定のための別のMS/MS法を設定します。取得方法のパラメータは、ステップ6.2で説明した最適化値に設定する必要があります。 ヒュームフードの下でイオン化溶媒を準備します。溶媒組成物は、目的の検剤に依存する。ここで使用される有機溶媒は、80%MeOH、10%DMSO、および0.1%ギ酸からなる。 測定の前に、適切な内部標準を有機溶媒と混合してください。この実験では、d5-タモキシフェンの5.31 nMを内部標準として使用しています。 偽陽性を避けるために、細胞部分のサンプリングを避けるために、一定の顕微鏡観察で1μmのボアサイズの毛細血管を使用して薬物で処理された細胞を取り囲む媒体を吸引する。 ローダー先端に取り付けたピペットを使用して、媒体を含む毛細血管の広い端にイオン化溶媒の2μLを加えます。次いで、MSによってサンプリングされた媒体を分析し、目的の検検の存在を確認する(通常、検出すべきではない)。 イオン化溶媒を細胞を含む毛細血管に2μLを加え、適切な質量分析計に接続されたナノエレクトロスプレーアダプター(ナノESI)にキャピラリーを固定し、自動取得方法を開始します。 7. 質量分析データの処理と分析 メモ:任意の適切なソフトウェアを使用してデータ分析を実行できます。ただし、研究者が MS ベンダーから提供されていないソフトウェアを使用してデータ分析を実行する場合は、生データを独自のベンダー形式からオープン形式に変換するか、最初にテキスト ファイルとして変換する必要があります (ここでは行いました)。 対象の検線のピーク面積を同じ MS スキャンの内部標準のピーク領域で割って、データを正規化します。次に、ピーク比をログ変換して歪度を低減します。 薬物またはその代謝産物の正規化された強度を箱ひげ図または密度曲線としてプロットし、単一細胞間の分布を可視化します。ここでは、R統計ソフトウェアがggplot2パッケージとともに使用される。 薬物代謝産物の豊富さを各細胞の代謝されていない親分子(すなわち、4-OHTおよびタモキシフェン)とで割ることによって、代謝されていない薬物比に代謝された薬物比を計算する。注:関心のある特定のラマンピークの変動と薬物またはその代謝産物のMSピークの変動との間の相関関係を調べることができる。これは、単一細胞における薬物自体とその代謝産物との間の可能な相関関係に追加される。これは、両側検定を使用してピアソン相関係数を計算することによって行うことができます。より高度な統合アプローチも考慮する必要があります。