Se presenta un protocolo para la síntesis de oligómeros peptoides codificados con información y para el autoensamblaje dirigido por secuencia de estos peptoides en escaleras moleculares utilizando aminas y aldehídos como pares reactivos covalentes dinámicos y Lewis de tierras raras ácidas metal triflos como reactivos multifunción.
Este protocolo presenta el uso de reactivos multifunciones ácidos Lewis para eludir la captura cinética observada durante el autoensamblaje de hebras oligoméricas codificadas en información mediadas por interacciones covalentes dinámicas emparejadas de una manera que imita el ciclo térmico comúnmente empleado para el autoensamblaje de secuencias de ácido nucleico complementarias. Los monómeros de aminas primarias que llevan aldehído y mitades colgantes de amina se funcionalizan con grupos de protección ortogonal para su uso como pares de reactivos covalentes dinámicos. Usando un sintetizador de péptidoautomatizado modificado, los monómeros de amina primaria se codifican en hebras oligo(peptoide) a través de la síntesis de sumonómero de fase sólida. Tras la purificación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la caracterización por espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS), los oligómeros específicos de la secuencia se someten a una alta carga de un triflato de metal de tierras raras ácido Lewis que desprotege las mitades de aldehído y afecta al equilibrio del par de reactivos de manera que las hebras se disocian por completo. Posteriormente, se extrae una fracción del ácido Lewis, lo que permite recocido de hebras complementarias específicas de secuencia para formar escaleras moleculares codificadas en información caracterizadas por espectrometría de masas de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-MS). El sencillo procedimiento descrito en este informe elude las trampas cinéticas que se experimentan comúnmente en el campo del ensamblaje covalente dinámico y sirve como plataforma para el diseño futuro de arquitecturas robustas y complejas.
El progreso en el autoensamblaje, el proceso mediante el cual las pequeñas subunidades generan arquitecturas más grandes a través de vías impulsadas termodinámicamente, ha dado un mejor control sobre las nanoestructuras macro y supramoleculares típicamente explotando interacciones intermoleculares tales como apilamiento y unión de hidrógeno1,2,3,4. En particular, los ácidos nucleicos (es decir, los polinucleótidos) han surgido como medios de nanoconstrucción notablemente versátiles como la alta densidad de información proporcionada por el emparejamiento de base Watson-Crick permite el montaje de estructuras complejas y selectivas en secuencia4,5. Mientras que la resistencia inherentemente baja de estos enlaces intermoleculares transitorios permite la reorganización de subunidades y la corrección de errores, las estructuras resultantes son a menudo susceptibles a la degradación térmica y mecánica6. Por el contrario, las interacciones covalentes dinámicas7,8,9, una clase de reacciones covalentes de formación de bonos que son reversibles o reorganizables en condiciones suaves y se han empleado recientemente para producir intrincadas macromoléculas como escaleras10,11,12,13, jaulas14,15,16,y pilas17, ofrecen mayores resistencias de unión y estructuras robustas. Desafortunadamente, la capacidad de reorganización y comprobación de errores se ve disminuida por las tasas de reorganización relativamente bajas de estas especies covalentes, reduciendo su capacidad de autoensamblaje en los productos deseados18. Para hacer frente a esta captura cinética, los catalizadores o las condiciones de reacción adversas se utilizan a menudo junto con bloques de construcción simples. Aquí, informamos de un proceso que elude la captura cinética para permitir el autoensamblaje de escaleras moleculares a partir de oligómeros específicos de secuencia donde la hibridación está dirigida por la información codificada en las secuencias de residuos de oligómeros.
Dada su accesibilidad sintética, la poli(N-sustituida glicina) (es decir, peptoides) se emplean como los precursores oligoméricos a partir de los cuales se ensamblan las escaleras moleculares19. Los peptoides son isómeros estructurales de péptidos en los que los grupos colgantes se fijan al nitrógeno transportado por la columna vertebral en lugar de acoplarse con el carbono20. Utilizando la síntesis de fase sólida, la colocación exacta de grupos colgantes covalentes dinámicos a lo largo de la cadena peptoide se logra fácilmente, lo que permite el diseño de oligomeros precursores que pueden ensamblar en estructuras supramoleculares complejas21.
La reorganización covalente dinámica de la conectividad imine se emplea en este procedimiento, ya que la reacción de condensación generadora de iminas proporciona un medio conveniente para caracterizar el autoensamblaje por espectrometría de masas, ya que cada enlace formado da como resultado una reducción de masa de 18 g/mol22. Además, el equilibrio entre los reactivos de amina y aldehído y el producto imine puede variar alterando la concentración de ácido. Específicamente, los triplanos metálicos de tierras raras se utilizan para afectar el equilibrio, y además desprotegen los aldehidos protegidos por etilentey23,24,25. Cabe señalar que el scandium triflate ya se utiliza comúnmente en el campo del autoensamblaje covalente dinámico, incluyendo su reciente éxito en la síntesis de marcos orgánicos covalentes (COF) a temperatura ambiente26,27. Además, la solubilidad contrastante de las secuencias oligo(peptoide) y el triflato metálico de tierras raras permite el control de equilibrio a través de la extracción líquido-líquido. El proceso notificado utiliza este control para eludir las barreras cinéticas que impiden el autoensamblaje dirigido por información.
La técnica aquí describe el conjunto covalente dinámico de los oligómeros peptoides que llevan información, donde la información se codifica en la secuencia de sus grupos colgantes. El uso de un monómero de amina protegido por Alloc junto con un monómero de aldehído protegido por acetal de etileno permite la desprotección ortogonal, permitiendo la desprotección de Alloc en la desprotección de perlas y acetales in situ durante la reacción de autoensamblaje, asegurando así que las secuencias sintetizadas no reaccionen prematuramente antes de la purificación y caracterización del oligomer. Es importante destacar que la síntesis de fase sólida se realiza utilizando una resina fotolábiliza para permitir el escote de oligomer a partir del cordón bajo irradiación de luz UV o violeta, excluyendo la desprotección prematura del grupo protector a base de ácido-lábil, a base de etileno acetal. Podrían considerarse varios esquemas alternativos de desprotección. Por ejemplo, inicialmente empleamos grupos de protección de ácido-lábil dual (Boc-amine y etileno acetal-aldehído) con la intención de desproteger in situ mediante un ácido fuerte seguido con neutralización para permitir que la reacción de autoensamblaje proceda; sin embargo, este enfoque dio lugar a la generación inmediata de precipitados sobre la adición de la base. Alternativamente, se concibió la protección de la amina con un grupo protector fotolabile, 2-(2-nitrofenil)propoxicarbonyl (NPPOC), ya que el aldehído podía desprotegerse selectivamente tras el tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) antes de la purificación. Desafortunadamente, la fotólisis in situ del grupo protector con luz UV no distulió la desprotección cuantitativa, incluso en presencia de fotosensibilizadores y después de largos períodos de irradiación25. Trimetilsilethoxycarbonyl (es decir, Teoc) puede emplearse como un grupo protector de aminas y está sujeto a escisión tras el tratamiento con triplanos metálicos de tierras raras; sin embargo, la desprotección cuantitativa del Teoc requiere cargas triflos de metal de tierras raras mucho más altas que las necesarias para la desprotección acetal de etileno. Para este protocolo, se pueden utilizar teoc-aminas, pero la concentración de ácido Lewis debe ajustarse en consecuencia, ya que la desprotección subcuantitativa de aminas podría resultar problemática para estructuras autoensambladas más grandes. Los grupos funcionales alifáticos fueron considerados brevemente, pero la desprotección de los aldehídos alifáticos requiere condiciones duras que truncan las secuencias peptoides32,33.
La incorporación de Neee y Nma como residuos espaciadores inertes sirven para mejorar la solubilidad de los oligómeros y permitir que el etiquetado masivo fácil de los oligomeros precursores permita la identificación lista de las especies generadas mediante espectroscopia de masas. Por otra parte, dada la conformación de peptoides de la lengua de “hebra” en las que los segmentos de la columna vertebral adyacentes adoptan estados rotacionales opuestos para formar un oligomero lineal, sin torsión34,35, secuencias que incorporan residuos de espaciador dinámicos e inertes alternativos facilita una estructura en la que los grupos colgantes reactivos están orientados en la misma dirección. Dada la versatilidad del método del sumidador, se puede emplear una biblioteca grande y diversa de aminas primarias para modificar aún más los oligómeros peptoides, pero puede requerir ajustes en el protocolo para mantener una alta eficiencia de acoplamiento.
Mientras que los oligo(peptoides) se pueden sintetizar manualmente en un recipiente de reacción de vidrio19, la automatización del proceso disminuye el tiempo para cada adición de residuos de varias horas a media hora. Además, la automatización disminuye la cantidad de residuos de monómeros y disolventes de lavado, especialmente deseable cuando se utilizan monómeros de aminas primarias que no están disponibles comercialmente. Aunque el escote de alloc de los residuos de amina protegida es una reacción eficiente, la oxidación del paladio puede dar lugar a una desprotección incompleta. En consecuencia, se sugiere probar la porción de resina y caracterizar el grado de desprotección con ESI-MS. Para los escotes de prueba, 30 min bajo 405 nm irradiación libera peptoide suficiente para espectrometría de masas. La desprotección parcial puede limitarse con el uso de condiciones anaeróbicas o la repetición de la reacción de desprotección.
Mientras que este artículo se centra en Sc(OTf)3 como un reactivo multifunción, se ha demostrado que otros triflates metálicos de tierras raras, como el triflato ytterbium, median con éxito el conjunto dirigido por información de escaleras moleculares. En particular, Sc(OTf)3 es el más ácido Lewis de los triflates metálicos de tierras raras; por lo tanto, debido a la capacidad catalítica reducida que ofrecen otros triplanos metálicos de tierras raras24,36, pueden ser necesarios mayores equivalentes para llevar a cabo la desprotección acetal de etileno completa y la disociación de hebras. El número de equivalentes requeridos puede determinarse con espectrometría de masas MALDI observando el punto en el que las hebras se disocian por completo. La disociación es fundamental en el proceso de autoensamblaje y es análoga a la fusión de hebras de ácido nucleico a temperatura elevada. La posterior extracción del catalizador permite la formación y interrupción de emparejamientos covalentes dinámicos que impulsan el montaje de dúplex específicos de la secuencia. Este recocido gradual de las hebras oligoméricas elude la captura cinética (que, para las escaleras moleculares, puede producir especies fuera del registro o emparejar secuencias incorrectamente) experimentada por otros métodos.
El cloroformo es un excelente disolvente como separación de fase en el sistema ternario de cloroformo/acetonitrilo utilizado aquí promueve la extracción parcial de ácido Lewis sin dar lugar a la precipitación de estructuras autoensambladas37. Además, el cloroformo es uno de los pocos disolventes que promueve la formación de iminas mientras mantiene la solubilidad de la escalera molecular. Las cantidades traza de dúplex fuera del registro y emparejados incorrectamente a menudo se pueden observar debido a la naturaleza dinámica del sistema. Aunque este sistema no se ve afectado en gran medida por una pequeña variación en las concentraciones de triplanos de metales de tierras raras tras la extracción, en ocasiones, la extracción insuficiente del catalizador genera una porción significativa de hibridación incompleta y acoplamientos de oligómeros no específicos. En este caso, generalmente es preferible volver a disociarse primero con otros 1,5 equivalentes de catalizador y luego extraer una segunda vez en lugar de volver a extraer inmediatamente, ya que la disociación completa de hebras individuales es vital para el proceso. Para ensamblar simultáneamente varias escaleras moleculares codificadas en información únicas, puede ser necesario aumentar la concentración de la solución de stock de triflato metálico de tierras raras utilizada para mantener equivalentes y volumen de reacción total.
Mientras que estos autoensamblajes se caracterizan principalmente por espectrometría de masas, otras técnicas como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) son posibles. Las limitaciones incluyen la cantidad de material necesario, la asequibilidad de los monómeros y la relación señal-ruido. Técnicas que requieren disolventes, como 1Rmn H, pueden sufrir además de insolubilidad de estructuras autoensambladas. Además, las concentraciones de triflato de metales de tierras raras posteriores a la extracción pueden determinarse mediante métodos como ICP-MS o 19F NMR con una norma interna.
A medida que avanza el progreso hacia un mejor control sobre las nanoestructuras y materiales macro moleculares y supramoleculares, surge el desafío de diseñar y fabricar conjuntos regulares, pero modificables. El protocolo descrito en este informe proporciona una vía para lograr dichas nanoestructuras a través de conjuntos selectivos de secuencia a través de interacciones covalentes dinámicas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, Oficina de Ciencias, Ciencias Básicas de la Energía, bajo el premio #DESC0012479. S.C.L. reconoce el apoyo del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias, y A.F.A. reconoce el apoyo de Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |