Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

Der NF-B-Signalweg wird als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen aktiviert, einschließlich Zytokine, mikrobielle Produkte und Stress, um die Expression von Zielgenen zu regulieren, die für entzündliche und Immunantwort, Zelltod oder Überleben und Proliferation verantwortlich sind¹. Pathologien wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen und Krebs^2,3,4,5 wurden mit der Hyperaktivierung des Signalwegs korreliert, die Modulation der NF-B-Aktivität zu einem Hauptziel für die Entwicklung neuer Therapien^6,7gemacht hat.

Insbesondere der kanonische NF-B-Signalweg unterscheidet sich von dem nicht-kanonischen Weg, der für die Lymphorganogenese und Die B-Zell-Aktivierung verantwortlich ist, durch die Abhängigkeit des erstgenannten vom Gerüstprotein NEMO (NF-B essential modulator⁸) für die Montage des IKK-Komplexes mit den Kiinasen IKK. Der IKK-Komplex ist verantwortlich für die Phosphorylierung von I-B (Inhibitor von B), die auf den Abbau abzielt, wodurch die NF-B-Dimere in den Kern für die Gentranskription¹ transloziert werden können und ist daher ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Inhibitoren zur Modulation der NF-B-Aktivität.

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen NEMO und IKK, die auf NEMO für die Entwicklung kleiner Moleküle Inhibitoren der IKK-Komplexbildung abzielt. Die minimale Bindungsdomäne von NEMO, die zur Bindung von IKK benötigt wird, umfasst die Rückstände 44-111, und ihre Struktur wurde komplex mit einem Peptid bestimmt, das der IKK-Sequenz 701-745⁹entspricht. NEMO und IKK bilden ein Vier-Helix-Bundle, in dem der NEMO-Dimer die beiden Helices von IKK(701-745) in einer länglichen offenen Nut mit einer erweiterten Interaktionsschnittstelle unterbringt. Der ikK(734-742), auch bekannt als NEMO-Bindungsdomäne (NBD), definiert den wichtigsten Hot-Spot für die Bindung, an dem die beiden wesentlichen Tryptophans (739,741) tief in der NEMO-Tasche vergraben sind. Die Details der komplexen Struktur können bei der strukturbasierten Gestaltung und Optimierung von kleinen Molekülinhibitoren helfen, die auf NEMO abzielen. Gleichzeitig ist es schwierig, dass die Bindung eines kleinen Moleküls oder Peptids in NEMO die vollständige Konformationsänderung (d. h. die umfangreiche Öffnung des NEMO-Spulendimers) durch Bindung des langen IKK(701-745), wie im Kristall beobachtet, wieder aufbaut und die Struktur eines ungebundenen NEMO oder NEMO, der an einen kleinen Molekülinhibitor gebunden ist, ein besseres Ziel für die strukturbasierte Entwicklung und Optimierung darstellen kann.

NEMO- und kleinere Schnittkonstrukte in voller Länge, die die IKK-Bindungsdomäne umfassen, haben sich über Röntgenkristallographie und Kernspinresonanz (NMR)-Methoden¹⁰als unlösbar für die Strukturbestimmung in der ungebundenen Form erwiesen, was uns dazu veranlasste, eine verbesserte Version der IKK-Bindungsdomäne von NEMO zu entwerfen. Tatsächlich ist NEMO (44-111) in ungebundener Form nur teilweise gefaltet und durchläuft einen Konformationsaustausch, und deshalb haben wir uns vorgenommen, seine dimerische Struktur, die gewickelte Spulenfalte und die Stabilität zu stabilisieren und gleichzeitig die Bindungsaffinität für IKK zu erhalten. Durch das Anhängen von drei Heptads mit idealen dimeren Coil-Spulensequenzen¹¹ an der N- und C-Termini des Proteins und einer Reihe von Vierpunktmutationen erzeugten wir NEMO-EEAA, ein Konstrukt, das vollständig dimer und in einer gewickelten Spule gefaltet wurde und die IKK-Bindungsaffinität zum Nanomolar-Bereich rettete, wie bei NEMO¹²in voller Länge beobachtet. Als zusätzlichen Vorteil hofften wir, dass die Coiled-Coil-Adapter (basierend auf der GCN4-Sequenz) die Kristallisation erleichtern und schließlich bei der Bestimmung der Röntgenstruktur durch molekularen Ersatz helfen würden. Coiled-Coil-Adapter wurden in ähnlicher Weise verwendet, um sowohl die Stabilität zu erhöhen, das Lösungsverhalten zu verbessern und die Kristallisation für trimergewickelte Coils und Antikörperfragmente zu erleichtern^13,14. NEMO-EEAA ist leicht exprimiert und gereinigt von Escherichia. coli-Zellen mit einem setakeablen Histidin-Tag, ist löslich, in einer stabilen dimeren gewickelten Spule gefaltet und leicht kristallisiert, mit Beugung bis 1,9 °C. Das Vorhandensein der geordneten Coiled-Coil-Regionen von GCN4 könnte zusätzlich dazu führen, dass die Daten aus Kristallen von NEMO-EEAA durch molekularen Ersatz unter Verwendung der bekannten Struktur von GCN4¹⁵schrittweise abgespult werden.

Angesichts der Ergebnisse, die mit apo-NEMO-EEAA erzielt wurden, glauben wir, dass die hier beschriebenen Protokolle auch auf die Kristallisation von NEMO-EEAA in Gegenwart von kleinen Peptiden (wie dem NBD-Peptid) oder kleinen Molekülinhibitoren angewendet werden könnten, mit dem Ziel, die Anforderungen an die NEMO-Hemmung und die strukturbasierte Optimierung von anfänglichen Bleiinhibitoren auf eine hohe Affinität zu verstehen. Angesichts der Plastizität und Dynamik vieler Coiled Coil-Domänen¹⁶könnte der Einsatz der Coiled-Coil-Adapter eine allgemeinere Anwendbarkeit bei der Unterstützung der Strukturbestimmung finden.