NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini
Summary
NEMO’nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.
Abstract
NEMO, IKK-kompleksini IKKα ve IKKβ ile birleştirerek NF-κB yolunda önemli bir rol oynayan bir iskele proteinidir. Aktivasyon üzerine IKK kompleksi, NF-κB nükleer translokasyonuna ve hedef genlerin aktivasyonuna yol açan IκB moleküllerini fosforilasyona yol açar. NEMO/IKK etkileşiminin inhibisyonu, NF-κB yol aktivitesinin modülasyonu için çekici bir terapötik paradigmaolup, NEMO’yu inhibitörlerin tasarımı ve keşfi için bir hedef haline getirerek. NEMO inhibitörlerinin keşif ve optimizasyon sürecini kolaylaştırmak için, nemo’nun IKK-bağlayıcı etki alanının, apo formunda ve küçük molekül ağırlık inhibitörlerine bağlı olarak proteinin yapı tayinine olanak sağlayacak geliştirilmiş bir yapı tasarladık. Burada, NEMO’nun IKK bağlayıcı alanının tasarımı, ifadesi ve yapısal karakterizasyonu için kullanılan stratejiyi sıyoruz. Protein E. coli hücrelerinde ifade edilir, denatüre koşulları altında çözünür ve üç kromatografik adım ile saflaştırılmış. Yapı belirleme için kristal elde etme protokollerini tartışıyor ve veri toplama ve analiz stratejilerini açıklıyoruz. Protokoller, NEMO ve küçük molekül inhibitörleri komplekslerinin yapı tayininde geniş uygulanabilirlik bulacaksınız.
Introduction
NF-κB yolu, inflamatuar ve immün yanıt, hücre ölümü veya sağkalım ve çoğalmasından sorumlu hedef genlerin ekspresyonunu düzenlemek için sitokinler, mikrobiyal ürünler ve stres gibi çeşitli uyaranlara yanıt olarak aktive edilir1. Enflamatuar ve otoimmün hastalıklar ve kanser2,3,4,5 gibi patolojiler, NF-κB aktivitesinin modülasyonunu yeni tedavilerin gelişimi için ana hedef haline getiren yolun hiperaktivasyonu ile ilişkili dir6,7.
Özellikle kanonik NF-κB yolu, ikk kompleksinin kinases IKKα ve IKKβ ile montajı için iskele proteini NEMO ‘ya (NF-κB temel modülatör8)olan lenforganogenez ve B hücre aktivasyonundan sorumlu kanonik olmayan patikadan ayrılır. IKK kompleksi, bozulmayı hedefleyen IκBα ‘nın (κB inhibitörü) fosforilasyonundan sorumludur, nf-κB dimerlerini gen transkripsiyon1 için çekirdeğe çevirmeye serbest düşürür ve bu nedenle NF-κB aktivitesini modüle etmek için inhibitörlerin geliştirilmesi için cazip bir hedeftir.
Araştırmamız, IKK kompleks oluşumunun küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesi için NEMO’yu hedefleyen NEMO ve IKKβ arasındaki protein-protein etkileşiminin karakterizasyonuna odaklanmaktadır. IKKβ’yı bağlamak için gereken NEMO’nun minimal bağlayıcı etki alanı, 44-111 artıklarını kapsar ve yapısı IKKβ dizisi 701-7459’akarşılık gelen bir peptit ile kompleks olarak belirlenmiştir. NEMO ve IKKβ, NEMO dimer’in ikkβ’nın (701-745) iki sarsıcısını genişletilmiş etkileşim arabirimine sahip uzatılmış açık olukta barındırdığı dört sarnıçlı bir paket oluşturur. IKKβ (734-742), aynı zamanda NEMO bağlayıcı etki alanı (NBD) olarak da bilinir, iki temel triptotreksin (739.741) NEMO cebine derinlemesine gömdükleri bağlama için en önemli sıcak noktayı tanımlar. Karmaşık yapının ayrıntıları, NEMO’yu hedef alan küçük molekül inhibitörlerinin yapı tabanlı tasarımına ve optimizasyonuna yardımcı olabilir. Aynı zamanda, küçük bir molekül veya peptid inbağlanması nemo tam konformasyonel değişim yeniden olacağını zordur (yani, NEMO bobin dimer geniş açılış) uzun IKKβ bağlanması nedeniyle (701-745), kristal gözlenen, ve küçük bir molekül inhibitörü bağlı bağlı NEMO veya NEMO yapısı yapı tabanlı tasarım ve inhibe edici ilaç ve inhibitör için daha iyi bir hedef temsil edebilir.
Ikk bağlayıcı etki alanını kapsayan tam uzunlukta NEMO ve daha küçük kesilme yapıları X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) yöntemleri 10 ile bağlanmamış formda yapı tayini için inatçı kanıtlanmıştır10, hangi bize NEMO IKK bağlayıcı etki geliştirilmiş bir sürümünü tasarlamak için istenir. Nitekim, NEMO (44-111) bağlanmamış formda sadece kısmen katlanmış ve konformasyonel değişim uğrar ve bu nedenle onun dimeric yapısı stabilize etmek için ayarlayın, bobin kıvrım ve istikrar, IKKβ için bağlayıcı yakınlık korurken. Proteinin N-ve C-termini’sinde ideal dimerik bobin dizilerinin11’ini ve dört noktalı mutasyonları üç heptads ekleyerek, tam uzunlukta NEMO12için gözlenen nanomolar aralığına IKK-bağlama afiyeti kurtardı bir yapı tamamen dimeric ve katlanmış nemo-EEAA, bir yapı oluşturduk. Ek bir avantaj olarak, bobin adaptörlerinin (GCN4 dizisine göre) kristalizasyonu kolaylaştıracağını ve sonunda moleküler değiştirme yoluyla X-ışını yapısı nın belirlenmesine yardımcı olacağını umduk. Bobin adaptörleri benzer şekilde hem stabiliteyi artırmak, hem çözüm davranışını iyileştirmek hem de trimerik sarmal bobinler ve antikor parçaları için kristalizasyonu kolaylaştırmak için kullanılmıştır13,14. NEMO-EEAA kolayca ifade edilir ve Escherichia. coli hücrelerinden bir dekolte Histidine etiketi ile saflaştırılmış, çözünür, kararlı bir dimerik bobin katlanmış ve kolayca kristalize, kırınımı ile 1.9 Å. GCN4’ün sıralı sarmal bobin bölgelerinin varlığı, GCN415’inbilinen yapısını kullanarak moleküler değiştirme ile NEMO-EEAA kristallerinden gelen verilerin kademeli olarak ele alınmasına yardımcı olabilir.
Apo-NEMO-EEAA ile elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, burada açıklanan protokollerin, NEMO inhibisyonu ve yüksek afiniteye ilk kurşun inhibitörlerinin yapı tabanlı optimizasyonu için gerekli şartları anlamak amacıyla, küçük peptidler (NBD peptid gibi) veya küçük molekül inhibitörleri varlığında NEMO-AÇAA’nın kristalizasyonuna da uygulanabileceğine inanıyoruz. Birçok sarmal-bobin etki16plastisite ve dinamik doğası göz önüne alındığında, sarmal-bobin adaptörleri kullanımı yapısal belirlenmesine yardımcı daha genel uygulanabilirlik bulabiliriz.
Protocol
Representative Results
Discussion
NEMO’nun bağlanmamış formda kristalizasyon girişimleri, tam uzunlukta protein ve IKK bağlayıcı etki alanını kapsayan çeşitli kesilme yapıları da dahil olmak üzere başarısız oldu. DAIRESEL dikromizm, NMR spektroskopisi ve floresan anisotropi ile NEMO IKK bağlayıcı etki alanı (kalıntı 44-111) bizim biyofiziksel karakterizasyonu, ikkβ bağlamak mümkün olsa da, konformasyonel değişimbir devlet var olduğunu gösterdi 9,10. Yaklaşımımız…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prof. Dr. Madden’e bu proje boyunca yaptığı birçok faydalı tartışma için teşekkür ederiz. Prof. Dr. D. Bolon’a optimize edilmiş GCN4 sarmal bobinini içeren plazmidin hediyesi için teşekkür ederiz. Dr. B. Guo’ya NEMO plazmidleri için teşekkür ederiz. Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili ve Amy E. Kennedy’ye prosedürü gösterdikleri için teşekkür ederiz. BioMT Kristalografi Çekirdek Tesisi ve Dartmouth’taki Biyokimya ve Hücre Biyolojisi bölümlerine kristalografi ekipmanlarının ve BioMT personelinin desteği için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Synchrotron Işık Kaynağı II, bir ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Ofis Bilim Kullanıcı Tesisi Brookhaven Ulusal Laboratuvarı tarafından DoE Ofis için sözleşmeli No altında işletilen AMX ışın hattı kullanılır. DE-SC0012704. NSLS II personeline desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH’nin R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 ve P20GM1131332 ve Munck-Pfefferkorn Roman ve İnteraktif hibeleri ile finanse edilmiştir.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
Referenzen
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
- Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
- Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
- Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
- Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
- Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
- Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
- Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemie. 53 (43), 6776-6785 (2014).
- Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
- Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
- Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).
- Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
- Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemie. 51 (47), 9581-9591 (2012).
- Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
- Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), (2019).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).
- Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
- Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Tickle, I. J., et al. . STARANISO. , (2018).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
- Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
- Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemie. 53 (50), 7929-7944 (2014).
- D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).
