Tomato Root Transformatie gevolgd door inenting met Ralstonia Solanacearum voor eenvoudige genetische analyse van bacteriële wilt ziekte

Ralstonia solanacearum, het oorzakelijk middel van bacteriële verwelkingsziekte, is een verwoestende bodem gedragen vasculaire ziekteverwekker met een wereldwijde distributie die een groot scala van plantensoorten kan infecteren, waaronder aardappel, tomaat, tabak, banaan, peper en aubergine, onder andere^1,2. Opbrengstverliezen veroorzaakt door Ralstonia kunnen 80-90% van de productie in tomaat, aardappel of banaan bereiken, afhankelijk van cultivar, klimaat, bodem en andere factoren³. Echter, de Ralstonia model is aanzienlijk onderonderzocht in vergelijking met andere modellen met bacteriële plantenpathogenen, zoals Pseudomonas syringae of Xanthomonas spp. Bovendien zijn de meeste studies in plantenmicrobe interacties gericht op de modelplant Arabidopsis thaliana. Hoewel onderzoek met behulp van deze modellen grotendeels heeft bijgedragen aan ons begrip van planten-bacteriën interacties, ze niet ingaan op de huidige noodzaak om deze interacties in gewasplanten te begrijpen. Onderzoek gericht op het begrijpen van de interactie tussen Ralstonia en gewasplanten is essentieel voor het ontwikkelen van duurzame oplossingen voor de bestrijding van bacteriële verwelkingziekte, maar wordt momenteel belemmerd door het ontbreken van eenvoudige experimentele testen om de verschillende componenten van de interactie te karakteriseren. In het bijzonder, tomaat, een natuurlijke gastheer voor Ralstonia, is de tweede belangrijkste groentegewas wereldwijd en wordt beïnvloed door een overvloed aan ziekten⁴, met inbegrip van bacteriële verwelking ziekte. In dit werk hebben we een eenvoudige methode ontwikkeld om genetische analyse van Ralstonia-infectie van tomaat uit te voeren. Deze methode is gebaseerd op Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van tomatenwortels, met behulp van DsRed fluorescentie als selectiemarker⁵, gevolgd door Ralstonia bodem-drenken van de resulterende planten, met getransformeerde wortels die de constructie van belang uitdrukken. De veelzijdigheid van de root transformatie test maakt het mogelijk het uitvoeren van ofwel gen overexpressie of gen uitschakeling bemiddeld door RNAi.

Een mogelijke beperking van deze methode bestaat uit de restgroei van niet-getransformeerde wortels. Dit is vooral belangrijk in de gevallen waarin de gebruikte plasmid een reportergen mist dat de selectie van getransformeerde wortels mogelijk maakt. Om dit probleem op te lossen, hebben we een alternatieve methode ontwikkeld op basis van antibioticaselectie, die de groei van niet-getransformeerde wortels remt en tegelijkertijd de groei van gezonde antibioticaresistente getransformeerde wortels mogelijk maakt. Aangezien A. rhizogenes de transformatie van scheuten niet induceert, zijn ze vatbaar voor het antibioticum en moeten ze daarom gescheiden worden gehouden van het antibioticahoudende medium.

Hoewel de weerstand van planten tegen Ralstonia niet goed wordt begrepen, hebben verschillende rapporten celwandwijzigingen geassocieerd met een verbeterde weerstand tegen bacteriële verwelking^6,7,8,9. Er is gesuggereerd dat deze celwandveranderingen de vasculaire ontwikkeling beïnvloeden, een essentieel aspect voor de levensstijl van Ralstonia in de plant¹⁰. Mutaties in genen die de cellulose synthases CESA4, CESA7 en CESA8 in Arabidopsis thaliana coderen, zijn aangetoond dat secundaire celwand integriteit schaden, waardoor een verbeterde weerstand tegen Ralstonia, die lijkt te zijn gekoppeld aan ABA signalering⁸. Daarom hebben we als proof of concept voor onze methode RNAi-gemedieerde genuitschakeling van SlCESA6 (Solyc02g072240), een secundaire celwandcellulose synthase en ortholog van AtCESA8 (At4g18780) uitgevoerd. Latere bodem-drenken inenting met Ralstonia bleek dat het uitschakelen van SlCESA6 verbeterde weerstand tegen bacteriële wilt symptomen, wat suggereert dat cel wandgemedieerde weerstand tegen Ralstonia is waarschijnlijk bewaard in tomaat, en valideren van onze methode uit te voeren genetische analyse van bacteriële wilt resistentie in wortels tomaat. Hier beschrijven we deze methode in detail, waardoor genetische benaderingen om bacteriële verwelkingziekte te begrijpen in een relatief korte tijd en met kleine eisen van apparatuur en plant groeiruimte.