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Entwicklungsbiologie

Determinação das Relações de Auto e Inter-(in)compatibilidade em Damasco combinando polinização manual, microscopia e análises genéticas

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

Apresentamos uma metodologia para estabelecer os requisitos de polinização das cultivares de damasco(Prunus armeniaca L.) combinando a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do S-genótipo pela análise pcr.

Abstract

A autoincompatibilidade em Rosaceae é determinada por um Sistema de Autoincompatibilidade Gametofitic (GSI) que é controlado principalmente pelo lócus multiloelico S. No damasco, a determinação das relações de auto e inter-(in)compatibilidade é cada vez mais importante, uma vez que a liberação de um importante número de novas cultivares resultou no aumento de cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Aqui, descrevemos uma metodologia que combina a determinação da auto-(in)compatibilidade por polinizações manuais e microscopia com a identificação do genótipo Spela análise pcr. Para a determinação de auto-(in)compatibilidade, foram coletadas flores em fase de balão de cada cultivar no campo, polinizado à mão em laboratório, fixado e manchado com azul anilina para observação do comportamento do tubo de pólen sob a microscopia de fluorescência. Para o estabelecimento de relações de incompatibilidade entre cultivares, o DNA Sde cada cultivar foi extraído de folhas jovens e S-alelos foram identificados pela PCR. Essa abordagem permite estabelecer grupos de incompatibilidade e elucidar relações de incompatibilidade entre cultivares, o que fornece informações valiosas para escolher polinizadores adequados na concepção de novos pomares e selecionar pais apropriados em programas de reprodução.

Introduction

A autoincompatibilidade é uma estratégia de floração das plantas para prevenir a auto polinização e promover o outcrossing1. Em Rosaceae, esse mecanismo é determinado por um Sistema de Autoincompatibilidade Gametofitic (GSI) que é controlado principalmente pelo lócus multitélico S2. No estilo, o gene RNase codifica o determinante S-stylar, um RNase3, enquanto uma proteína F-box, que determina o determinante do pólen S,é codificada pelo gene SFB 4. A interação de autoincompatibilidade ocorre através da inibição do crescimento do tubo de pólen ao longo do estilo que impede a fertilização do ovule5,6.

No damasco, uma renovação varietal ocorreu em todo o mundo nas últimas duas décadas7,8. Essa introdução de um importante número de novas cultivares, de diferentes programas de reprodução pública e privada, resultou no aumento de cultivares de damasco com requisitos desconhecidos de polinização8.

Diferentes metodologias têm sido usadas para determinar os requisitos de polinização em damasco. No campo, a auto-compatibilidade pode ser estabelecida por polinização controlada em árvores enjauladas ou em flores emasculadas e,posteriormente,registrando o percentual de conjunto de frutas9,10,,11,12. Além disso, polinizações controladas têm sido realizadas em laboratório pela cultura semi-in vivo de flores e análise do comportamento do tubo de pólen sob microscopia de fluorescência8,,13,,14,,15,,16,17. Recentemente, técnicas moleculares, como análise e sequenciamento de PCR, permitiram a caracterização de relações de incompatibilidade com base no estudo dos genes RNase e SFB 18,19. No damasco, foram relatados 33 S-alelos(S1 a S20, S22 a S30, S52, S53, Sv, Sx), incluindo um alelo relacionado com auto-compatibilidade(Sc)12, 18,,18,20,,21,,22,,23,,24. Até agora, 26 grupos de incompatibilidade foram estabelecidos nesta espécie de acordo com o S-genótipo8,9,17,25,26,27. Cultivares com os mesmos alelos Ssão intercompatíveis, enquanto cultivares com pelo menos um s-alelodiferente e, consequentemente, alocados em diferentes grupos incompatíveis, são intercompatíveis.

Para definir os requisitos de polinização das cultivares de damasco, descrevemos uma metodologia que combina a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do genótipo Spela análise pcr em cultivares de damasco. Essa abordagem permite estabelecer grupos de incompatibilidade e elucidar relações de incompatibilidade entre cultivares.

Protocol

1. Determinação de auto-(in)compatibilidade Prove as flores no campo. É necessário coletar as flores no estágio do balão(Figura 1A),correspondente ao estágio 58 na escala BBCH para damasco28, para evitar polinização prévia indesejada. Polinizações auto e cruzadas em laboratório Retire os anteratos das flores no estágio do balão e coloque-os em um pedaço de papel para secar à temperatura …

Representative Results

Estudos de polinização em damasco exigem o uso de flores na fase final do balão um dia antes da anestesia (Figura 1A). Esta etapa é considerada a mais favorável tanto para a coleta de pólen quanto para pistil, uma vez que as estruturas florais estão quase maduras, mas a deshiscência anther ainda não ocorreu. Isso evita a interferência de pólen indesejado, não só de pólen da mesma flor, mas também de outras flores, uma vez que as pétalas fechadas impedem a che…

Discussion

Tradicionalmente, a maioria das cultivares europeias de damasco comercial eram autocompatíveis36. No entanto, o uso de cultivares autocompatíveis norte-americanas como pais em programas de reprodução nas últimas décadas resultou na liberação de um número crescente de novas cultivares auto-incompatíveis com requisitos de polinização desconhecidos7,,8,,37. Assim, a determinação das relações …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Regional Development Fund, União Europeia (AGL2016-77267-R e AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-000); Gobierno de Aragón-European Social Fund, União Europeia (Grupo Consolidado A12_17R), Fundação Biodiversidad e Agroseguro S.A.

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
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Referenzen

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Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
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