Visualisation et analyse du transport intracellulaire d'organites et d'autres cargaisons dans les astrocytes

Les astrocytes sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central adulte, où ils exécutent des fonctions développementales et homéostatiques uniques¹. Les astrocytes modulent le développement synaptique par le contact direct avec les terminaux pré- et postsynaptiques dans le cadre de la synapse tri-partite, qui contient des récepteurs de neurotransmetteur, des transporteurs, et des molécules d’adhérence de cellules qui facilitent la formation de synapse et la communication neuronale-astrocyte². En outre, les astrocytes contrôlent activement la transmission synaptique et empêchent l’excitotoxicité neuronale en supprimant rapidement les neurotransmetteurs excitatifs de la fente synaptique, en recyclant les neurotransmetteurs et en participant à l’élagage synaptique^{3 , 4 ( en} plus) ^{, 5 Annonces , 6.}Pour activer ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux, avec d’autres cellules gliales, et avec les neurones par le biais de protéines membranaires spécialisées, y compris les molécules d’adhérence cellulaire, les aquaporines, les canaux ioniques, les transporteurs de neurotransmetteurs et les molécules de jonction d’écart. Les astrocytes modifient activement les niveaux de surface de ces protéines en réponse aux fluctuations de leur environnement intra- et extracellulaire⁷. En outre, les changements dans les niveaux et la distribution des mitochondries, des gouttelettes lipidiques et des organites dégradatifs et de recyclage modulent l’approvisionnement énergétique, la disponibilité des métabolites et les processus de compensation cellulaire qui sont essentiels à la fonction des astrocytes et survie.

Les changements dynamiques dans le trafic de protéines membranaires et d’organelle et le positionnement dans les astrocytes sont facilités par la fonction concertée des protéines motrices et des adaptateurs qui favorisent la motilité de la cargaison^8,9. De même, les niveaux de surface des protéines membranaires sont modulés par l’internalisation et le recyclage des événements¹⁰. Ces cargaisons sont transportées par un réseau complexe d’actine, de microtubules et peut-être de filaments intermédiaires⁸. Les études basées sur la coloration d’immunofluorescence de la protéine de liaison final 1 (EB1), qui s’accumule au microtubule croissant plus extrémités, suggèrent que dans les faisceaux d’astrocytes des microtubules rayonnent hors du périnucleus et d’étendre leur extrémité plus vers le périphérie¹¹. Cependant, un examen complet de l’organisation et de la polarité des microtubules et d’autres éléments cytosquelettiques utilisant la formation image de cellules vivantes manque toujours. Tandis que beaucoup des mécanismes sous-jacents à la dynamique des organelles et des protéines membranaires ont été intensivement étudiés dans les neurones et d’autres types de cellules, la motilité de cargaison dans les astrocytes est moins bien comprise. La plupart de nos connaissances actuelles sur les changements dans la distribution des protéines et des organites dans les astrocytes est basée sur l’étiquetage traditionnel à base d’anticorps de la préparation fixe, ce qui empêche l’examen spatial et temporel précis de la dynamique du fret^{7, 12}.

Ici, nous décrivons une méthode pour étiqueter des protéines de membrane et des organites pour l’imagerie vivante dans les cultures primaires d’astrocyte de souris de haute pureté. À l’aide de ce protocole, nous fournissons des exemples dans lesquels nous suivons la localisation dynamique des protéines de membrane fluorescentes vertes (GFP) dans les astrocytes transfectés, y compris la connexine de protéine de jonction d’écart 43 (Cx43-GFP) et l’acide aminé excitateur transporteur 1 (EAAT1-GFP). Nous décrivons également l’utilisation d’une sonde acidotrope fluorescente pour visualiser les organites acides et suivre leur dynamique de trafic dans les astrocytes vivants. Enfin, nous démontrons comment analyser les données time-lapse pour extraire et évaluer les paramètres de transport des cargaisons individuelles.