말라세지아 와 쥐를 감염. 곰팡이 - 호스트 상호 작용을 연구하기 위해

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 스위스 연방 환경 청(www.bafu.admin.ch)의 포함된 시스템에서 유기체 취급에 관한 조례에 따라 수행되었습니다. 마우스 실험은 스위스 동물 보호법의 지침에 따라 엄격하게 수행되었으며 스위스 취리히 주 수의청에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다(라이센스 번호 168/2018). 1. 실험실 조건하에서 말라세지아 재배 참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약과 매체를 실온(RT, 20 – 25°C)에 보관하십시오. 말라세지아 성장을 위해 액체 변형 딕슨(mDixon) 배지를 준비한다. 액체 mDixon 배지 의 500 mL을 준비하려면, 용해 18 g 맥아 추출물, 10 g 건조 옥스 담즙, 5 mL 트웬- 40, 3 g 페톤, 1 mL 글리세롤 과 1 mL 올레산 500 mL 증류H2O (dH2O). HCl 및 오토클레이브로 배지를 pH 6으로 조정합니다. 매체를 RT에 저장합니다. 오토클레이브 전에 500 mDixon 배지에 7.5 g의 한천을 추가하여 mDixon 한천 플레이트를 준비합니다. 천천히 냉각하는 동안 매체의 부분 응고를 방지하기 위해 스티어링 바와 자기 가열 플레이트를 사용하여 오토 클레이브 후 mDixon 한천을 냉각. 한천을 50 -60 °C로 식히면 액체를 페트리 접시에 넣고 층류 후드에 넣고 RT에서 하룻밤 동안 건조시십시오.참고 : 한천 플레이트는 증발을 피하기 위해 포장하고 거꾸로 보관 할 때 몇 주 동안 4 °C에서 보관 할 수 있습니다. 공급자가 얻은 지침에 따라 말라세지아를 분리하고 말라세지아의 동구형 주식을 부활시. 공급자가 얻은 지침에 따라 부활된 말라세지아 현탁액과 함께 멸균 된 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 액체 mDixon 배지10 mDixon 배지를 접종하십시오. 30°C 및 180 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 배양한다. 크림 색과 탁도의 모양을 확인하여 정기적으로 말라세지아 문화의 성장을 검사합니다. 성장 역학은 말라세지아의 종과 균주에 따라 달라지며 말라세지아가 동약증으로 된 주식에서 신선하게 부활할 때 특히 느릴 수 있습니다. (그림1A). mDixon 배지에 조밀하게 자란 말라세지아 배양물의 3부분을 멸균 99% 글리세롤의 1부분과 혼합하여 글리세롤 주식을 준비합니다. Malassezia/글리세롤혼합물을 멸균 스크류 캡 튜브에 넣고 -80°C에 보관합니다. 시험관 내 전파를 위해, 접종 루프를 사용하여 mDixon 또는 냉동 글리세롤 스톡으로부터 mDixon 한천 플레이트(4°C로부터 RT로 가져온)에서 액체 배양으로부터 Malassezia 플레이트를 접종루프를 사용한다.참고: mDixon 한천 플레이트를 사용 전에 4°C에서 RT로 옮기면, 차가운 mDixon 한천은 곰팡이 성장을 억제합니다. 30°C에서 (비흔들림) 인큐베이터에서 말라세지아와 함께 한천판을 거꾸로 인큐베이션한다. 정기적으로 말라세지아 식민지의 성장을 검사합니다.참고 : mDixon 한천 접시에 Malassezia 식민지는 3 – 5 일 이내에 나타나고 크림 색의 칙칙하고 볼록한 고도가 부드럽습니다(그림 1B). 말라세지아 식민지를 mDixon 한천 접시에 RT에서 ~ 2주 동안 보관하십시오. 그 후, 1.7에 설명된 바와 같이 냉동 글리세롤 스톡으로부터 말라세지아를 줄무늬로 새로운 mDixon 한천 플레이트를 준비한다. 2. 마우스의 실험 말라세지아 감염에 대한 접종의 준비 10 mDixon 배지의 액체 mDixon 배지를 멸균 된 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 3 – 5 개별 말라세지아 콜로니를 mDixon 한천 플레이트에서 접종합니다 (단계 1, 그림 1B참조). 30°C 및 180 rpm에서 ~ 48~96h에 대해 말라세지아 배양을 배양하고 배양할 때까지 크림색 및 탁한 배양(도1A).참고 : 말라세지아 성장에 필요한 시간은 말라세지아 종과 균주 및 접종에 사용되는 곰팡이의 양에 달려 있습니다. 말라세지아 배양액의 2 mL을 멸균 된 2 mL 미세 원심 분리튜브 및 원심 분리기를 10, 000 x g에서 1 분 동안 옮김. 상급체를 버리고 인산완제 염용액(PBS)의 1 mL에 펠릿을 일시 중단하여 세척합니다. 원심 분리기 10, 000 x g에서1 분 동안 다시 . 세척 후, 활발한 파이펫팅에 의해 PBS의 1 mL에서 펠릿을 중단하고 분광계를 사용하여 600 nm (ODA600)에서용액의 광학 밀도를 측정합니다. OD 측정을 위해 PBS로 Malassezia 서스펜션 20 – 50 x를 희석하여 판독값이 0.1과 1 사이임을 확인합니다.참고 : 말라세지아의 3 일 배양의 밀도는 일반적으로 Malassezia 종과 균주에 따라 배양 접종에 사용되는 효모 세포의 수에 따라 15 및 30 ODA600사이에서 다릅니다 (단계 2.1). Malassezia는 응집체를 형성하는 경향이, 따라서, 활발한 파이펫팅은 현탁액의 균질성을 보장하기 위해 필요하다. 멸균 2 mL 튜브내로 4 ODA600의 밀도에 해당하는 PBS에서 Malassezia 현탁액의 부피를 Aliquot. 감염될 동물 당 튜브 1개준비합니다. 10, 000 x g에서 1 분 동안 말라세지아를 포함하는 튜브를 원심 분리기. 상류를 버리고 200 μL의 천연 올리브 오일 (2 ODA600 효모 세포 / 100 μl 올리브 오일에 해당)에 Malassezia 펠릿을 일시 중단하십시오.참고 : 올리브 오일은 말라세지아가 친유성 및 지질 의존 효모이기 때문에 말라세지아와의한 피상적 감염에 좋은 수단으로 밝혀졌습니다. 올리브 오일은 PBS보다 피부에 더 잘 흡수됩니다. 그러나 올리브 오일에 말라세지아를 중단시키는 것은 쉽지 않다는 점에 유의하십시오. 소용돌이에 의해 말라세지아/ 올리브 오일 현탁액을 개선하십시오. 감염에 사용될 때까지 RT에서 현탁액을 유지하십시오. 제어 동물의 모의 감염에 대한 혼자 올리브 오일 튜브를 준비합니다. 3. 말라세치아와 쥐를 감염 6-8주 된 생쥐를 6-8주 에 주문하고 적어도 1주일 동안 실험 동물 시설에서 적응할 수 있도록 하십시오. 감염되지 않은 대조군을 포함하여 그룹당 3-5개의 마우스를 계산합니다. PBS에서 1.3 mg/mL 자일라진과 6.5 mg/mL 케타민을 함유한 멸균 마취 칵테일을 준비합니다. 5 mL의 마취 칵테일은 20 마리의 동물을 마취시키기에 충분합니다. 마취될 동물의 수에 따라 칵테일의 부피를 조정한다. 마취 칵테일의 10 μL/g 체중을 복강 내 (킬로그램 체중 당 65 mg 케타민 및 13 mg 자일라진에 해당)를 주입하여 동물을 마취시키고 마취 된 동물을 37 °C의 가열 패드에 놓습니다.참고 : 표시된 복용량에서 동물은 보통 ~ 30 – 60 분 동안 마취 된 상태로 유지됩니다. 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 집게로 뒷발을 꼬집어 반사 신경을 확인하십시오. 마취 중 탈수증을 방지하기 위해 눈위에 아이크림을 바르고 있습니다. 선택적으로 캘리퍼스(0 – 5mm 범위)를 사용하여 양쪽 귀의 귀 두께를 측정합니다. 각 귀의 두 개의 서로 다른 영역을 측정하고 귀당 평균 귀 두께를 계산합니다.참고: 귀 두께를 측정하는 것은 선택 사항이며 연구 질문에 따라 다릅니다. 그러나, 귀 두께가 피부 염증에 대한 판독값으로 사용되는 경우, 감염 전에 기준선 귀 두께를 측정 할 필요가있다. (4단계 참조). 선택적으로, 가벼운 테이프 스트리핑에 의해 등쪽 귀 피부의 표피 장벽을 방해 : 수동으로 피부에 테이프의 작은 조각을 적용하고 다시 제거. 각 라운드에 신선한 테이프를 사용하여 5 회 연속 반복합니다.참고: Malassezia는 교란되지 않은 피부에 비해 장벽이 붕괴된 피부에서 더 뚜렷한 피부 염증을 유발합니다(그림 2A)7. 멸균 피펫을 사용하여 각 귀의 등쪽 면에 Malassezia/올리브오일 현탁액의 100 μL(2 ODA600)을국소적으로 적용합니다. 올리브 오일만으로 처리되는 동물의 대조군을 포함한다(비차량 처리 대조군).참고: 말라세지아/올리브오일 현탁액을 소용돌이치며 적용 직전에 균일한 말라세지아 현탁액을 보장합니다. 마취 된 동물을 가열 패드에 두어 저체온증을 피하십시오 (수염 운동, 호흡 속도 증가 등)이 나타날 때까지. 200 μL의 멸균 및 사전 데운 2% 포도당 용액을 nuchal fold에 피하주사하여 신진대사와 재수화를 지원합니다.참고: 멸균 2% 포도당 용액을 준비하려면 50 mL PBS에 1 mg의 포도당을 용해시키고 0.2 μm 필터를 사용하여 여과하십시오. 용액은 4°C에서 보관할 수 있다. 동물을 케이지로 다시 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김. 4. 말라세지아-유도 피부 염증의 분석 참고 :이 절차는 피부 염증의 매개 변수 역할을 감염 중 Malassezia-유도 귀 붓기의 분석을 설명합니다. 곰팡이 유발 귀 부종을 분석하기위한 전제 조건은 테이프 스트리핑 및 / 또는 감염 전에 기준선 귀 두께를 측정하는 것입니다 (단계 3.5). 말라세지아의단기 마취를위한 이소플루란 챔버를 준비 -감염 및 제어 동물. 한 번에 한 개의 동물을 챔버로 옮기고 동물이 완전히 마취될 때까지 기다립니다.참고 : 적절한 마취의 징후는 완전한 신체 이완뿐만 아니라 느리고 무거운 (측면) 호흡을 포함한다. 이소플루란에 대한 장기간 노출이 치명적일 수 있기 때문에 마취를 주의 깊게 모니터링하십시오. 챔버에서 동물을 제거하고 조직에 놓습니다. 캘리퍼스(범위 0 – 5mm)를 사용하여 귀의 두께를 측정합니다. 각 귀의 두 개의 서로 다른 영역을 측정하고 귀당 평균 두께를 계산합니다(단계 3.5 참조). 동물을 케이지로 다시 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮참고 : 이소플루란 마취는 매우 수명이 짧으며 동물은 이소플루란 챔버에서 제거 한 후 ~ 30 s 이내에 회복됩니다. 테이프 스트리핑 및/또는 감염 이전에 측정된 평균 기준선 귀 두께를 감염 후 각 시점에서 측정된 평균 귀 두께에서 빼서 귀 두께의 증가를 계산합니다. 계산된 값을 귀 두께의 증가로 또는, 또는, 각 동물 또는 동물군에 대한 시간에 따라 총 귀 두께로서 플롯한다(도2B). 5. 감염된 피부의 곰팡이 부담 분석 dH 2 O에 0.5 mL의 멸균 0.05% NP40을 함유하고 오토클레이브 강철 볼(직경5mm)을 포함하는 각 귀에 멸균 2 mL 미세원심분리튜브를 준비합니다. 정밀 저울을 사용하여 튜브의 무게를 측정하고 정확한 무게를 적어 둡니다. CO2 질식에 의해 마우스를 안락사시한다. 5.1-5.2단계에서 설명한 바와 같이, 기지에서 귀를 제거하고 0.5 mL의 멸균 0.05% NP40을 dH2O로함유하는 튜브내로 이송한다. 귀 조직을 포함하는 튜브를 계량하고 기관과 튜브의 무게에서 기관없이 튜브의 무게를 빼서 각 샘플의 실제 무게를 계산합니다. 조직 균질화를 사용하여 25 Hz에서 6 분 동안 귀 조직을 균질화하십시오. 조직이 잘 균질화되었는지 확인하십시오. 각 샘플의 플레이트 100 μL (각 균질, 희석 인자 = 5의 1/5에 해당)을 mDixon 한천 플레이트에 놓고 30°C 인큐베이터에서 거꾸로 플레이트를 배양합니다.참고 : 균질 도금의 양은 예상되는 곰팡이 하중에 따라 조정되어야합니다. 쉽게 열거할 수 있도록 플레이트당 최소 10개 이하의 콜로니를 얻기 에 충분한 균질화를 플레이트해야 합니다. 선택적으로, 균질의 다른 희석과 샘플 당 여러 플레이트. 정기적으로 말라세지아 식민지의 성장을 검사합니다.참고 : 식민지는 일반적으로 2 – 3 일 후에 볼 수 있습니다. 말라세지아 식민지가 성장하는 데 필요한 시간은 말라세지아의종과 균주에 따라 달라집니다. 접시 당 식민지를 계산합니다. 다음 수식을 사용하여 CFU/g 조직의 수를 계산합니다.CFU/g 조직 = (콜로니/플레이트 수) x (희석 인자) / (g의 피부 샘플의 무게).참고: 최소 검출 한계는 최소 검출 한계 = (1 콜로니/플레이트) x (희석 인자) / (g의 모든 피부 샘플의 평균 중량)을 사용하여 평가할 수 있다. 곰팡이 하중은 일반적으로 로그 계척도(그림2C)로플롯됩니다.