Infecter des souris avec Malassezia spp. pour étudier l'interaction fungus-hôte

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément à l’ordonnance sur la manipulation des organismes dans les systèmes contenus de l’Office fédéral de l’environnement, en Suisse (www.bafu.admin.ch). Les expériences sur la souris ont été menées dans le strict respect des directives de la Loi suisse sur la protection des animaux et ont été réalisées selon les protocoles approuvés par l’Office vétérinaire du canton de Zurich, en Suisse (numéro de licence 168/2018). 1. Cultivation de Malassezia dans des conditions de laboratoire REMARQUE : Conservez tous les réactifs et les supports utilisés pour ce protocole à température ambiante (RT, 20 à 25 oC) sauf indication contraire, car la température plus basse peut inhiber la croissance fongique. Préparer le liquide modifié Dixon (mDixon) milieu pour la croissance Malassezia. Pour préparer 500 mL de mDixon liquide, dissoudre 18 g d’extrait de malt, 10 g de bile de bœuf desséchée, 5 mL de tween-40, 3 g de peptone, 1 mL de glycérol et 1 mL d’acide oleique en 500 ml distillé H2O (dH2O). Ajuster le milieu à pH 6 avec HCl et autoclave. Stockez le support chez RT. Préparer les plaques d’agar mDixon en ajoutant 7,5 g d’agar à 500 mL mDixon moyen avant l’autoclacage. Refroidir lentement l’agar mDixon après l’autoclacage à l’aide d’une barre de direction et d’une plaque de chauffage magnétique pour éviter une solidification partielle du milieu pendant le refroidissement. Une fois que l’agar a refroidi jusqu’à 50 à 60 oC, distribuez le liquide dans les plats Petri dans une hotte à écoulement laminaire et laissez-les sécher à RT pendant la nuit.REMARQUE : Les plaques d’agar peuvent être stockées à 4 oC pendant plusieurs semaines lorsqu’elles sont enveloppées et conservées à l’envers pour éviter l’évaporation. Obtenir malassezia isole et raviver les stocks lyophilisés de Malassezia selon les instructions obtenues par le fournisseur. Inoculer 10 ml de mDixon liquide dans un flacon erlenmeyer stérile de 100 mL avec la suspension Malassezia relancée selon les instructions obtenues par le fournisseur. Incuber la culture dans un incubateur secouant à 30 oC et 180 tr/min. Inspectez régulièrement la croissance de la culture Malassezia en vérifiant l’apparence de la couleur crème et de la turbidité. La cinétique de croissance dépend de l’espèce et de la souche de Malassezia et peut être particulièrement lente lorsque Malassezia est fraîchement réanimé d’un stock lyophilisé. (Figure 1A). Préparer les stocks de glycérol en mélangeant 3 parties de la culture De Malassezia densément cultivée dans le milieu mDixon avec 1 partie de glycérol stérile à 99 %. Aliquot le mélange Malassezia/glycéroldans des tubes à bouchons à vis stériles et stocker à -80 oC. Pour la propagation in vitro, plaqueZ Malassezia de la culture liquide dans mDixon ou du stock de glycérol congelé sur une plaque d’agar mDixon (apportée à RT à partir de 4 oC) à l’aide d’une boucle d’inoculation.REMARQUE : Transférer les plaques d’agar mDixon à RT à partir de 4 oC avant l’utilisation, puisque l’agar mDixon froid inhibe la croissance fongique. Incuber la plaque d’agar (s) avec Malassezia à l’envers dans un incubateur (non-secouant) à 30 oC. Inspecter régulièrement la croissance des colonies de Malassezia.REMARQUE : Les colonies de Malassezia sur les plaques d’agar de mDixon apparaissent dans les 3 à 5 jours et sont ternes de couleur crème, lisses avec l’élévation convexe (figure 1B). Stockez les colonies de Malassezia sur des plaques d’agar mDixon à RT pendant 2 semaines. Par la suite, préparer une nouvelle plaque d’agar mDixon en striant Malassezia du stock de glycérol congelé tel que décrit dans 1.7. 2. Préparation de l’inoculum pour l’infection expérimentale de Malassezia des souris Inoculer 10 ml de mDixon liquide dans un flacon erlenmeyer stérile de 100 ml avec 3 à 5 colonies individuelles de Malassezia à partir d’une plaque d’agar mDixon (voir l’étape 1, Figure 1B). Incuber la culture Malassezia pour 48 à 96 h à 30 oC et 180 tr/min jusqu’à ce que la culture soit de couleur crème et turbide(figure 1A).REMARQUE : Le temps nécessaire à la croissance de Malassezia dépend de l’espèce et de la souche Malassezia et de la quantité de champignons utilisés pour l’inoculation. Transférer 2 ml de la culture Malassezia dans un tube stérile de 2 mL de microcentrifuge et une centrifugeuse pendant 1 min à 10 000 x g. Jeter le supernatant et laver le granule en le suspendant dans 1 ml de solution de sel tamponnée au phosphate (PBS). Centrifugeuse à nouveau pendant 1 min à 10 000 x g. Après le lavage, suspendre la pastille dans 1 ml de PBS par tuyauterie vigoureuse et mesurer la densité optique de la solution à 600 nm (ODA600) à l’aide d’un spectromètre. Diluer la suspension Malassezia 20 à 50 x avec PBS pour la mesure OD pour s’assurer que la lecture se situe entre 0,1 et 1.REMARQUE : La densité d’une culture de Malassezia de 3 jours varie généralement entre 15 et 30 ODA600, selon l’espèce et la souche de Malassezia et sur le nombre de cellules de levure utilisées pour l’inoculation de la culture (étape 2.1). Malassezia a tendance à former des agrégats, par conséquent, un tuyauterie vigoureux est nécessaire pour assurer l’homogénéité de la suspension. Aliquot un volume de la suspension Malassezia en PBS qui correspond à une densité de 4 ODA600 dans un tube stérile de 2 ml. Préparer 1 tube par animal à infecter. Centrifuger les tubes contenant Malassezia pendant 1 min à 10 000 x g. Jeter le supernatant et suspendre le granule de Malassezia dans 200 l d’huile d’olive indigène (correspondant à 2 cellules de levure ODA600/100 ‘l huile d’olive).REMARQUE: L’huile d’olive s’est avérée être un bon véhicule pour l’infection épicutanée avec Malassezia, comme Malassezia est une levure lipophile et lipidique-dépendante. L’huile d’olive est mieux absorbée par la peau que le PBS. Cependant, sachez qu’il n’est pas facile de suspendre Malassezia à l’huile d’olive. Améliorer la suspension Malassezia/huiled’olive par vortex. Gardez la suspension à RT jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour l’infection. Préparer les tubes avec de l’huile d’olive seul pour l’infection simulée des animaux témoins. 3. Infecter des souris avec Malassezia Commandez des souris femelles C57BL/6 à l’âge de 6 à 8 semaines et laissez-les s’acclimater dans l’établissement animalier expérimental pendant au moins une semaine. Calculez pour 3 – 5 souris par groupe, y compris un groupe témoin non infecté. Préparer un cocktail anesthésique stérile contenant 1,3 mg/mL de xylazine et 6,5 mg/mL de kétamine dans PBS. 5 ml du cocktail anesthésique suffit à anesthésier 20 animaux. Ajuster le volume du cocktail en fonction du nombre d’animaux à anesthésier. Anesthésiez les animaux en injectant 10 l/g de poids corporel anesthésique intrapéritone (correspondant à 65 mg de kétamine et 13 mg de Xylazine par kg) et placez les animaux anesthésiés sur un coussin chauffant à 37 oC.REMARQUE : À la dose indiquée, les animaux restent habituellement anesthésiés pendant 30 à 60 min. Vérifiez les réflexes en pinçant le pied arrière avec des forceps pour s’assurer que les animaux sont entièrement anesthésiés. Appliquer une crème pour les yeux sur les yeux pour prévenir la déshydratation pendant l’anesthésie. En option, mesurer l’épaisseur de l’oreille des deux oreilles à l’aide d’un étrier (0 à 5 mm de portée). Mesurez deux zones différentes de chaque oreille et calculez l’épaisseur moyenne de l’oreille par oreille.REMARQUE : La mesure de l’épaisseur de l’oreille est facultative et dépend de la question de recherche. Cependant, si l’épaisseur de l’oreille est utilisée comme une lecture pour l’inflammation de la peau, il est nécessaire de mesurer l’épaisseur de l’oreille de base avant l’infection. (voir étape 4). Optionnellement, perturber la barrière épidermique de la peau de l’oreille dorsale par un léger décapage du ruban adhésif : appliquez manuellement un petit morceau de ruban adhésif sur la peau et retirez-la à nouveau. Répéter l’opération pendant 5 tours consécutifs à l’aide d’un morceau de ruban adhésif frais pour chaque tour.REMARQUE : La malassezie induit une inflammation de la peau plus prononcée dans la peau perturbée par la barrière par rapport à la peau non perturbée (Figure 2A)7. Appliquer topiquement 100 oL (2 ODA600) de la suspension À l’huile d’olive Malasseziasur le côté dorsal de chaque oreille à l’aide d’une pipette stérile. Inclure un groupe témoin d’animaux qui sont traités avec de l’huile d’olive seulement (groupe témoin traité par véhicule).REMARQUE : Vortex la suspension Malassezia/huile d’olive vigoureusement pour assurer une suspension homogène de Malassezia immédiatement avant l’application. Laissez les animaux anesthésiés sur le coussin chauffant pour éviter l’hypothermie jusqu’à ce qu’ils montrent des signes de rétablissement (mouvement de la moustache, augmentation du taux de respiration, etc.). Injecter 200 L de solution de glucose stérile et pré-chauffée de 2 % sous-cutanée dans le pli nucal pour soutenir leur métabolisme et leur réhydratation.REMARQUE : Pour préparer une solution stérile de 2 % de glucose, dissoudre 1 mg de glucose dans 50 ml de PBS et filtrer à l’aide d’un filtre de 0,2 m. La solution peut être stockée à 4 oC. Retransférer les animaux dans leur cage. 4. Analyse de Malassezia-inflammation cutanée induite REMARQUE : Cette procédure décrit l’analyse de malassezia-induitle gonflement d’oreille pendant l’infection qui sert de paramètre de l’inflammation de peau. Une condition préalable pour analyser l’enflure induite par le champignon d’oreille est de mesurer l’épaisseur de base d’oreille avant le décapage de bande et/ou l’infection (étape 3.5). Préparer la chambre isoflurane pour l’anesthésie à court terme des animaux malassezia-infectéset contrôler. Transférer un animal à la fois à la chambre et attendre que l’animal soit entièrement anesthésié.REMARQUE : Les signes d’une bonne anesthésie comprennent une relaxation complète du corps ainsi qu’une respiration lente et lourde (flank). Surveiller attentivement l’anesthésie car une exposition prolongée à l’isoflurane peut être fatale. Retirer l’animal de la chambre et le placer sur un mouchoir. Mesurer l’épaisseur de l’oreille à l’aide d’un étrier (gamme 0 à 5 mm). Mesurez deux zones différentes de chaque oreille et calculez l’épaisseur moyenne par oreille (voir l’étape 3.5). Transférer l’animal dans la cage.REMARQUE : L’anesthésie d’isoflurane est de très courte durée, et les animaux récupèrent dans les 30 s après l’enlèvement de la chambre d’isoflurane. Calculez l’augmentation de l’épaisseur de l’oreille en soustrayant l’épaisseur moyenne de l’oreille de base, mesurée avant le décapage du ruban adhésif et/ou l’infection, à partir de l’épaisseur moyenne de l’oreille mesurée à chaque moment après l’infection. Tracer les valeurs calculées comme l’augmentation de l’épaisseur de l’oreille ou, subsidiairement, comme l’épaisseur totale de l’oreille au fil du temps pour chaque animal ou groupe d’animaux (Figure 2B). 5. Analyse du fardeau fongique dans la peau infectée Préparer un tube de microcentrifuge sterile de 2 ml pour chaque oreille à récolter, contenant 0,5 mL de NP40 stérile 0,05% en dH2O et une boule d’acier autoclaved (5 mm de diamètre). Pesez les tubes à l’aide d’un équilibre de précision et notez le poids précis. Euthanasier les souris par asphyxie au CO2. Retirez l’oreille à la base et transférez-la dans le tube contenant 0,5 ml de NP40 stérile de 0,05 % en dH2O, tel que décrit dans les étapes 5.1 – 5.2. Peser le tube contenant le tissu auditif et calculer le poids réel de chaque échantillon en soustrayant le poids du tube sans l’organe du poids du tube avec l’organe. Homogénéiser le tissu auditif pendant 6 min à 25 Hz à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire. Assurez-vous que le tissu est bien homogénéisé. Plaque 100 ‘L de chaque échantillon (correspondant à 1/5 de chaque homogénéisme, facteur de dilution 5) sur les plaques d’agar mDixon et incuber les plaques à l’envers dans un incubateur de 30 oC.REMARQUE : La quantité d’homogénéisation plaquée doit être ajustée en fonction de la charge fongique à prévoir. Assurez-vous d’enfaire suffisamment d’homogénéité pour obtenir au moins 10 colonies et pas plus de 250 colonies par assiette pour permettre un recensement facile. Optionnellement, plaquer plusieurs plaques par échantillon avec différentes dilutions d’homogénéisation. Inspecter régulièrement la croissance des colonies de Malassezia.REMARQUE : Les colonies deviennent généralement visibles après 2 à 3 jours. Le temps nécessaire à la croissance des colonies de Malassezia dépend de l’espèce et de la souche de Malassezia. Comptez les colonies par assiette. Calculez le nombre de tissus CFU/g en utilisant la formule suivante :CFU/g tissu – (nombre de colonies/plaque) x (facteur de dilution) / (poids de l’échantillon de peau en g).REMARQUE : La limite minimale approximative de détection peut être évaluée à l’aide de la formule suivante : limite minimale de détection (1 colonie/plaque) x (facteur de dilution) / (poids moyen de tous les échantillons de peau en g). Les charges fongiques sont généralement tracées à l’échelle logarithmique (figure 2C).