أصابه الفئران مع Malassezia spp. لدراسة التفاعل بين الفطريات والمضيف
Summary
هذا البروتوكول يحدد إنشاء نموذج الماوس لدراسة Malassezia-التفاعلات المضيف في الجلد. وهو يصف زراعه malassezia في المختبر ، والعدوى من الجلد murine مع malassezia، والتحليل اللاحق للالتهاب والعبء الفطري في انسجه الجلد.
Abstract
نماذج الحيوانية هي حاسمه للبحوث الامراض المعدية. وهي توفر أساسا هاما لتحليل الطيف الكامل للتفاعلات التي تحدث بين الميكروبات ومضيفها في الجسم المجري بطريقه خاصه بالانسجه. ويتزايد الاعتراف الفطريات المسببة للامراض باعتبارها تهديدا خطيرا للبشر واستغلال مثل هذه النماذج العدوى تحسنت إلى حد كبير فهمنا للامراضيه الفطرية. أنواع من جنس Malassezia هي الفطريات الأكثر وفره من الكائنات المجهرية الجلد البشري وانها ترتبط أيضا مع تطور اضطرابات جلديه التهابيه شديده مثل التهاب الجلد الدهني والتهاب الجلد التاتبي. ومع ذلك ، لا تزال العلاقة السببية بين malassezia والامراض المرضية غير معروفه ، وهي الحقيقة التي يمكن ان تعزي إلى المعرفة السيئة من الساق المعقدة من malassezia مع الجهاز المناعي الجلد. يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج الماوس التجريبية التي تسمح بدراسة تفاعل Malassezia مع الجلد الثدييات في الجسم الخارجي. فانه يحدد طريقه لزراعه Malassezia spp. في ظل الظروف المختبرية ، وكيفيه أصابه الجلد murine مع malassezia spp. وكيفيه تقييم نتيجة العدوى عن طريق التهاب الجلد وتحليلات عبء الفطرية. النموذج الموصوف هنا يعمل في الحيوانية المناعية تماما ولا يعتمد علي المعالجة المناعية أو المعالجة بالمضادات الحيوية للحيوانات. وعلاوة علي ذلك قابله للتكيف مع جميع سلالات الماوس المعدلة وراثيا تقريبا ويمكن الجمع بينها وبين نماذج أخرى للامراض الجلدية. هذه الميزات تجعل هذا النموذج العدوى أداه قويه جدا للدراسة بالتفصيل استجابه المناعية الفطرية والمتكيفة للمضيف ضد Malassezia في الجلد في الجسم المجري.
Introduction
يتم ملء الجلد من قبل العديد من الميكروبات المختلفة. التعرض المستمر للجلد إلى الجراثيم يساهم في تشكيل وتثقيف الجهاز المناعي للمضيف. ويتزايد الاعتراف بالفطريات كجزء حيوي من الجراثيم وانها تفي بدور هام لفسيولوجيا المضيف والحصانة, مماثله للبكتيريا والفيروسات1. الأنواع من جنس malassezia هي إلى حد بعيد الفطريات الأكثر وفره استعمار الجلد من الفقاريات ذوات الدم الحار وانها تشكل لأكثر من 90 ٪ من الجلد البشري المتفيسوم2،3. وقد تم حتى الآن تحديد ثمانيه عشر نوعا مختلفا من Malassezia من الجلد البشري والحيواني4.
ويعتقد ان الامراض المختلفة للجلد تنشا ، علي الأقل جزئيا ، نتيجة لتركيب الجراثيم الدقيقة ديستوازن. قد يؤدي ديسبيوسيس إلى فرط نمو الأنواع مع المحتملة المسببة للامراض مما يؤدي إلى العدوى الانتهازية والمرض5. باستمرار ، هناك أدله متزايدة علي ان Malassezia، بالاضافه إلى نمط الحياة المعلقة ، ويسهم في تطوير مختلف الامراض الجلدية ، بدءا من القشرة والمبرقشة فيرسيكولور إلى اضطرابات التهابيه أكثر شده مثل كما التهاب الجلد الدهني والتهاب الجلد التاتبي4،6. في حين تم تاسيس العلاقة السببية بين Malassezia والمبرقشة فيرسيكولور ، فان الدور الفسيولوجي للفطريات في امراض الجلد الأكثر شده لا يزال غير معروف إلى حد كبير.
تحديد دور Malassezia في التوازن الجلد والمرض يستدعي المزيد من المعرفة المتعمقة حول تفاعل الفطريات مع الجلد والجهاز المناعي الجلدي. من الملاحظة ، والبحوث علي Malassezia هو ، بالمقارنة مع غيرها من مسببات الامراض الفطرية البشرية (علي سبيل المثال ، المبيضات الbicans أو التبخير الرشاشيات) ، لا يزال في مرحله الوليدة. ويمكن ان يعزي هذا إلى صعوبة في زراعه Malassezia تحت الظروف المختبرية وعدم وجود نماذج تجريبية مناسبه لدراسة الفطريات في اتصال مع المضيف في الجسم المجري. التجارب السابقة مع الخلايا المعزولة في الثقافة أشارت إلى مجموعه واسعه من التفاعلات المباشرة وغير المباشرة بين Malassezia ومختلف الخلايا المناعية وغير المناعية7. ومع ذلك ، هذه التجارب في المختبر فقط يلخص جزئيا حاله بيئة الجلد المعقدة في الجسم الذي يحدث فيه العديد من الاحداث الخلوية والجزيئية بشكل متزامن بين الفطريات وأنواع الخلايا المختلفة.
هنا ، ونحن الخطوط العريضة للبروتوكول لنموذج تجريبي من العدوى Malassezia الجلد في الفئران ، والتي انشانا مؤخرا ، لدراسة الفطريات-التفاعل المضيف في الجسم الخارجي7. وهذا يشمل إجراءات (1) الزراعة الناجحة لل malassezia في المختبر ، (2) تطبيق وخز من malassezia علي جلد الاذن murine ، و (3) التفاصيل التقنية لكيفيه تحليل الجلد المستحث malassezia التهاب والعبء الفطري للجلد المصاب. الأهم من ذلك ، هذا النموذج لا يعتمد علي كبت المناعة (علي سبيل المثال ، بواسطة الكورتيكوستيرويدات) أو العلاج بالمضادات الحيوية للفئران قبل العدوى ، كما انه يمارس في نماذج الماوس الأخرى من العدوى الفطرية8،9. المقابل ، فانه يسمح بدراسة الطيف الكامل للاستجابة المناعية الفطرية والمتكيفة ضد الملاسزيا في الجلد الطبيعي. من الملاحظة ، الفئران نوع البرية التي يتم الاحتفاظ بها تحت ظروف محدده خاليه من العوامل الممرضة (SPF) ليست مستعمره بطبيعة الحال مع Malassezia ، التالي ، تعرضها للفطريات لا يؤدي إلى الاستعمار المستمر ولكن يتم مسح من المضيف داخل حوالي 1.5 أسابيع. ومع ذلك ، فان النموذج يسمح لدراسة أليات لمكافحه الإيدز المضيف البدء والتنظيم الذي ، بدوره ، هو أساس كيفيه توليد الذاكرة المناعية. النموذج هو تنوعا في انه يمكن بسهوله تطبيقها علي مجموعه واسعه من سلالات الماوس المعدلة وراثيا ، ويمكن الجمع بينها مع غيرها من نماذج الامراض الجلدية القائمة ، مثل نماذج من نقص الحاجز ، لدراسة تاثير Malassezia تحت الامراض الجلدية المرضية والتهابات7. ولذلك ، فان النموذج الموصوف من العدوى الجلدية Malassezia التجريبية في الفئران يوفر درجه عاليه من المرونة للتحقيق في تفاعل الفطريات مع الجهاز المناعي الجلد في سياق التوازن والمرض.
يصف هذا البروتوكول العدوى الجلدية التجريبية للفئران مع Malassezia spp. ونظرا لإمكاناتها المسببة للامراض ، تصنف malassezia SPP علي انها BSL2 مسببات الامراض في بعض البلدان ، بما في ذلك سويسرا. يرجى التحقق من المبادئ التوجيهية المحلية واتباع اللوائح من قبل السلطات المحلية. وينبغي التعامل مع الكائنات BSL2 المصنفة من قبل موظفين مدربين في اطار مجلس السلامة البيولوجية BSL2 المعتمدة (BSC). وينبغي ان تكون النفايات البيولوجية الملوثة بالكائنات الحية المصنفة BSL2 ، وكذلك الجثث التي تصيب الفئران المصابة بهذه الكائنات ، معقمه قبل التخلص منها. لاجراء تجارب مع الفئران ، ينبغي بذل كل الجهود للتقليل من المعاناة وضمان اعلي المعايير الاخلاقيه والانسانيه وفقا لمبادئ 3R (استبدال ، صقل ، خفض)10. وأجريت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول مع باتشيديرماتيس (atcc 14522) ، m. نخاله (atcc 14521) و m. سمبوديليس (atcc 42132)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول عدوي الجلد من سلاله الماوس التي يشيع استخدامها C57BL/6 من قبل Malassezia Spp. تكييف هذا البروتوكول مع سلالات الماوس الأخرى مع خلفيه وراثيه مختلفه (علي سبيل المثال ، balb/c) أو إلى الماوس المعدلة وراثيا سلالات قد تحتاج إلى تعديل جرعه العدوى ، والنقطة الزمنيه (ق) من التحليل ، الخ. لضمان استنساخ ، يجب ان تكون مجموعات الفئران دائما من نفس العمر والجنس. وينبغي إبقاء مصدر الفئران مستقرا ، حيث ان التغيرات الطفيفة في الخلفية الجينية والاختلافات في الكائنات المجهرية ، الموجودة بين البائعين والتي قد توجد حتى بين الوحدات المختلفة لمنشاه تكاثر واحده ، يمكن ان يكون لها تاثير لا يمكن التنبؤ به علي مسار العدوى. عند اعداد نموذج العدوى Malassezia الموصوفة في هذا البروتوكول ، ينصح باجراء دراسة تجريبية لرصد بعناية مسار العدوى ، بما في ذلك مدي الاستعمار ، وحركيه التطهير الفطرية ودرجه التهاب وعلم الامراض التي قد تكون مستحثه (علي سبيل المثال ، إذا كانت بشره الاذن معطله قبل الاصابه) لتحديد ظروف الفحص الأمثل.
ولضمان الاستنساخ والكشف الموثوق عن الاختلافات بين المجموعات التجريبية ، يجب حساب عدد الماشية المستخدمة لكل مجموعه استنادا إلى التحليل الإحصائي. يتم احتساب حجم العينة استنادا إلى حجم التاثير ومعدل الخطا والطاقة ، والتي تعتبر الاختلافات البيولوجية والتجريبية (علي سبيل المثال ، بسبب الاختلاف في الجهاز المناعي). لأسباب اخلاقيه تجنب استخدام اعداد عاليه بدون داع من الماشية. وفيما يتعلق بعدوي الجلد Malassezia ، وعلاج الاذن واحد فقط مع الفطريات واستخدام الاذن الأخرى كعنصر تحكم داخل الماوس نفسه ، لا ينصح لان الفئران قد تنتشر الفطريات لكلا الاذنين عند الاستمالة. ومع ذلك ، باستخدام 1/2 الاذن لمختلف وسائل القراءة المنهجية مثل تحديد عبء الفطرية ، وعزل الخلايا المناعية أو التحليل النسيجي هو في كثير من الأحيان ما يكفي ويؤدي إلى انخفاض كبير في اعداد الحيوانية المستخدمة للتجارب.
وقد وصفت 18 نوعا مختلفا من Malassezia حتى الآن. الاختلافات بين والاستقراء داخل جنس Malassezia يمكن ان تؤثر علي التفاعل مع المضيف ، كما تعلمنا أيضا من الدراسات علي الفطريات الأخرى المسببة للامراض البشرية13. مختلف أنواع malassezia وسلالات تختلف في أصلها (علي سبيل المثال ، باتشيديرماتيس هو الأنواع الأكثر شيوعا معزولة عن الماشية ، في حين m. التقييدية، m. جلوبوزا و m. سمبوديليس هي الأكثر أعضاء بارزين من الجلد الفطري الميكروبيوم في البشر مع توزيع متغير من هذه الأنواع بين مناطق الجلد المختلفة). وقد ارتبطت بعض الأنواع بالعلاقات المعلقة ، في حين يعتقد ان البعض الآخر أكثر تعرضا للامراض ، رغم ان الادله المفصلة لا تزال ضعيفه نسبيا. والاهم من ذلك ، ان بعض الأنواع والسلالات هي بطبيعتها أكثر صعوبة في النمو من غيرها. التالي ، فان القرار الذي الأنواع/سلاله لاستخدامها للعدوى يجب ان تستند إلى مساله البحث.
العدوى التجريبية من الجلد murine مع بعض الكائنات الميكروبية مثل المبيضات الbicans أو المكورات العنقودية الذهبية تتطلب تعطيل حاجز البشرة قبل العدوى ، علي سبيل المثال ، مع ورقه الرمل14، 15و16. وعلي النقيض من ذلك ، فان نموذج العدوى Malassezia الموصوفة هنا هو فعال علي قدم المساواة مع وبدون انقطاع حاجز7. يتم تعزيز درجه التهاب الناجم عن الفطريات علي نطاق واسع إذا تم تجريد الجلد من الشريط قبل الاصابه7. ولذلك ، ما إذا كان ينبغي التلاعب الجلد قبل تطبيق Malassezia يعتمد علي سؤال البحث. نماذج مختلفه من التهاب الجلد المزمن والحاد (علي سبيل المثال ، نماذج لفرط الحساسية نوع تاخر (دث) والاتصال فرط الحساسية (CHS)) ونماذج من نقص الحاجز الموجودة التي قد تكون ذات فائده للتحقيق في مساهمه الخميرة المعلقة للامراض الجلدية.
الفئران التي تم الاحتفاظ بها تحت ظروف محدده الممرض الحرة (SPF) هي (علي حد علمنا) لا استعمرت بطبيعة الحال مع Malassezia. ولذلك ، فان التطبيق التجريبي من Malassezia إلى الاذن الماوس الجلد يمثل التعرض الاولي للفطريات التي تدفع استجابه حاده في المضيف ، والتي بدورها يؤدي إلى أزاله الفطرية في غضون 1-2 أسابيع7. في حين ان النموذج الموصوف في هذا البروتوكول يعكس جزئيا فقط الوضع في البشر المناعي أو غيرها من الكائنات المضيفة التي استعمرت بشكل دائم مع Malassezia, العدوى التجريبية يسمح نافذه وافره من فرصه لدراسة المناعة المضادة للفطريات واليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء هذه الاستجابة. كما انه يسمح بالتحقيق في الاختلافات في الاستجابة للأنواع المختلفة من الملاسزيا والسلالات في ظل ظروف تجريبية مختلفه (علي سبيل المثال ، مع وبدون انقطاع حاجز الجلد).
وكانت دراسة Malassezia -التفاعلات المضيف محدوده في الماضي إلى التجارب في المختبر مع أنواع الخلايا المعزولة في الثقافات (علي سبيل المثال ، خطوط الخلايا الكيراتينيه ، pbmcmcmcccmcccccc). علي الرغم من ان هذه الدراسات قد تسلط بعض الضوء علي العوامل الفطرية والمضيفة التي تشكل التفاعل بين Malassezia والمضيف17، فانها لا تسمح للحصول علي فهم شامل للتفاعل الفطريات-المضيف في المجمع بيئة الجلد ، والتي تنطوي علي أنواع متعددة من الخلايا التي هي في الاتصالات المستمرة ، مثل الخلايا الكيراتينيه ، الليفية والانسجه المقيمة في الخلية المناعية ، ولكن أيضا السكان الكريات البيضاء التي تخترق الانسجه فقط علي لقاء الميكروبية لل الجلد. هذه الشبكة متعددة الخلايا لا يمكن استنساخها بالبالكامل في النماذج في المختبر ، حتى مع الانظمه العضوية الأكثر تقدما. وهكذا ، فان العدوى التجريبية من الفئران لا تزال تمثل معيار الذهب في المناعة والبحوث الامراض المعدية ، وتوافر النموذج الموصوف هنا يمثل طفرة في مجال البحوث Malassezia . الأهم من ذلك ، يعتمد هذا النموذج علي التطبيق وخز من Malassezia علي الجلد الاذن الفاره غير مضطربة ، وانه لا توريط التلقيح من الفطريات عن طريق الحقن في الانسجه ، علي سبيل المثال ، جلد أو داخل الصفاق ، كما أفادت الدراسات السابقة عن18، وكلاهما أكثر بعدا عن الوضع في المضيفين المستعمرين بشكل طبيعي.
امكانيه الجمع بين نموذج من العدوى Malassezia الموصوفة في هذا البروتوكول مع غيرها من نماذج الماوس المتاحة يزيد كثيرا من نطاق ومرونة التطبيق. وتشمل هذه الاخيره نماذج مختلفه من الاضطرابات الجلدية المحددة ، مثل نموذج نقص الحاجز الذي يحاكي السمات الهامه من التهاب الجلد التاتبي ، وهو مرض يرتبط مع Malassezia في كل من البشر والقطط. وعلاوة علي ذلك ، يمكن بسهوله تطبيق العدوى وخز من الجلد مع Malassezia علي الفئران مع العيوب الوراثية في الجينات المضيفة من الفائدة ، أو الفئران التي يتم حذف نوع الخلية من الفائدة وراثيا أو يمكن ان تكون المنضب الدوائية (علي سبيل المثال ، من خلال وسائل أداره سموم الخناق في الفئران التي تعبر عن سموم الخناق. وتمثل هذه النماذج أداه حتمية لتشريح استجابه المضيف للميكروبات المعلقة والميكروبات المسببة للامراض ، بما في ذلك Malassezia، ولتقييم دور هذه الجينات ونوع الخلية في التفاعل بين الفطريات والمضيف. ويمكن توسيع التحليلات من التفاعل Malassezia-الجلد المضيف ابعد بكثير من ما هو موضح في هذا البروتوكول. وتشمل هذه التحليلات عن طريق علم الانسجه (علي سبيل المثال ، لتحديد درجه علم الامراض الجلدية أو سماكه البشرة الناجمة عن الفطريات) ، عن طريق مناعي أو تلطيخ المناعية من أقسام الانسجه باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد نوع الخلية علامات محدده أو جزيئات أخرى من الفائدة. وقد تنطوي أيضا علي عزل الخلايا (علي سبيل المثال ، الانسجه المقيمة أو التسلل الانسجه الكريات البيضاء مجموعات فرعيه) من انسجه الجلد المصابة لدراسة الاستقطاب ، والتنظيم ، وديناميكية الاستجابة المناعية إلى Malassezia في عمق كبير.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم جامعه زيورخ ، سويسرا.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | – | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | – | – | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | – | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
Referenzen
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- . . Malassezia and the Skin. , (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocols. 7 (4), 637-642 (2012).
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
