제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이
Summary
이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.
Abstract
수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 주요 시각적 투영은 신경 연결의 발달을 통제하는 기계장치를 공부하기위한 훌륭한 모델 시스템 역할을합니다. 레티노-tectal 투영의 설치 도중, 광학 축색은 눈에서 확장하고 그들의 표적 조직, 광학 tectum에 도달하기 위하여 두뇌의 별개의 지구를 통해서 탐색합니다. 일단 광학 축새가 tectum에 들어가면, 그(것)들은 tectum에 있는 표적 interneurons로 만들 수 있는 시냅스 연결의 수를 증가하기 위하여 기능하는 말단 아버를 정교하게 합니다. 여기서, 우리는 제노푸스 배아에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 DNA를 발현하는 방법, 및 이득-기능 상실 유전자 구성, 광뉴런(망막 신경절 세포)을 발현하는 방법을 설명한다. 우리는 외인성 유전자가 광학 뉴런의 단 하나 또는 작은 수에서 표현되는 그래야 1 일 오래된 태아의 안구에 결합된 DNA/lipofection 시약을 마이크로 주입하는 방법을 설명합니다. GFP와 유전자를 태그하거나 GFP 플라스미드와 공동 주입함으로써, 변형 된 분자 신호를 가진 개별 광학 뉴런의 말단 축삭 아버는 며칠 후 살아있는 제노푸스 올챙이, 그리고 그들의 형태에 따라 그대로 뇌에서 직접 이미지화 될 수 있습니다. 정량화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 광학 축색 아버라이드의 개발을 뒷받침하는 세포 자율 분자 메커니즘의 결정을 가능하게 합니다.
Introduction
신경계의 발달 도중, 시냅스 전 신경의 축세포는 그들의 표적 지역에 도달하기 위하여 두뇌의 다양한 지구를 통해서 탐색합니다. 축 삭 그들의 대상 조직을 침공 하는 때, 그들은 synaptic 대상 뉴런시 연결을 설정. 뉴런의 많은 모형에서, 축세포는 말단 가지 또는 아버1의정교하게 네트워크를 정교하게 하여 만들 수 있는 시냅스 연결의 수 그리고 공간 넓이 증가합니다. 수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 레티노 tectal 투영은 말단 축삭 수목화 및 시냅스 연결성2,3,4의 근본적인 메커니즘을 검사하기위한 강력한 척추 동물 모델입니다. . 정상 및 변경된 분자 신호로 광학 축색 아버를 발현하는 개별 GFP는 그대로 관찰할 수 있으며, 살아있는 제노푸스 올챙이5,6,7,8. GFP를 단독으로 또는 소수의 광학 뉴런에서 전체 길이 또는 잘린 유전자 버전과 함께 표현하기 위해, 우리는 1 일 오래 된 제노푸스 배아의 안구에 DNA의 미세 주입 / 지질 을 포함하는 기술을 사용합니다9, 10. 이 기술은 원래 젊은 제노푸스 올챙이에서 광학 축색 경로 발견의 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었으며, 이후 광학 축작의 기본 세포 자율 분자 메커니즘을 결정하기 위해 우리와 다른 사람에 의해 적용되었습니다 제노푸스 올챙이5,6 ,7,8,9,10의수료화 .
소수의 광학 뉴런에서 외인성 유전자를 발현하는 대체 기술은 X. laevis뿐만아니라 다른 모델 종에서도 개발되었다. 그러나, 이 접근의 각각은 제노푸스 태아의 안구부에서 DNA/lipofection 시약의 미세 주입과 비교될 때 도전과 한계를 제시합니다. 마우스에서, 트랜스제네시스는 소수의 광학 뉴런에서 유전자를 발현하는데 사용될 수 있지만, 형질전환 마우스의 생성은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리고 형질전환 마우스는 종종 바람직하지 않은부작용(11)으로존재한다. 광학 뉴런에서 외인성 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬는 또한 초기 절단 단계배아(12)에플라스미드를 주입함으로써 생성될 수 있다. 그러나, 이러한 과정은 제브라피쉬유충(12)에서광학 뉴런에서 모자이크 패턴으로 유전자를 발현하기 위해 특정 프로모터의 복제를 요구한다. 형질전환 제브라피시의 광학 뉴런에서 외인성 DNA의 발현 빈도도 다소 낮습니다(<30%). DNA/리포좀 시약(30−60%)으로 미세주입된 제노푸스 올챙이와비교하면 12. 오보에서 전기천공은 또한 병아리13에서소수의 광학 뉴런에서 유전자를 발현하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이 절차는 광학 축사 arborization가 살아있는 병아리 배아에서 상연될 수 없기 때문에 광학 투영을 설치하는 기계장치를 완전히 특성화하는 것을 실패했습니다. 마지막으로, 몇몇 실험실은 제노푸스 올챙이14,15에있는 소수의 광학 뉴런으로 유전자를 트랜스펙트하기 위하여 전기천기를 이용했습니다. 그러나 전기포공은 제노푸스 배아의 안구에 DNA/지방 흡입 시약을 미세 주입하는 데 사용되는 것 이상으로 장비 및 프로토콜(자극기, 전극, 공간 및 시간적 파펄스 패턴)의 최적화가 필요합니다.
우리와 다른 사람들은 이전에 광학 축세포 arborization5,6을설치하는 세포 자율 신호 메커니즘을 결정하기 위해 제노푸스 배아의 안구에 DNA의 미세 주입 / lipofection의 기술을사용했습니다. 7명 , 8. 우리는 처음에 제노푸스 올챙이5,6에서광학 축색 아버화에서 Cadherin 및 Wnt 어댑터 단백질 β-카테닌의 기능을 해부하기 위해이 방법을사용했다. 한 연구에서는, β-카테닌이 α-카테닌 및 PDZ에 결합하는 것을 각각 생체 내에서 광학 축삭 아버를 시작하고 형성하기 위해 필요하다는 것을 보여주었다5. 제2 보고에서, 우리는 α-카테닌 및 GSK-3β에 대한 β-카테닌 결합 도메인이 복부 광학 축삭 아버의 투영 패턴을 반대로 조절한다는 것을입증했다 6. 최근에는 제노푸스 올챙이7에서광학 축색 아버의 형태학적 특징을 조절하는 Wnt 요인, 선종성 poliposis coli (APC)에 대한 역할을 확인했습니다. 개별 광학 뉴런에서 GFP와 함께 β-카테닌 안정성 및 미세소관 조직을 조절하는 APC의 N-말단 및 중앙 도메인을 공동 표현함으로써, 우리는 분기 번호에서 이러한 APC 상호 작용 도메인에 대한 공유및 뚜렷한 역할을 결정했습니다. 길이, 및 생체 내 축축아의 각도7. 또 다른 실험실은 제노푸스 올챙이8의광학 축색 아버에서 BDNF 수용체, TrkB에 의한 신호에 대한 세포 자율적 역할을 결정하기 위해 미세 주입/지질 주입 기술을 사용했다. 이 그룹은 생체 내 개별 광학 축아에서 지배적 인 음의 TrkB 교란 분기 및 시냅스 성숙의 발현을 보여주었다8. 전반적으로, 제노푸스의 지질 기술은 이미 네이티브 환경에서 광학 축색 분지에서 다른 유전자의 특정 역할을 조명했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 단일 또는 소수의 광학 뉴런에서 외인성 DNA 구조를 표현하는 방법과 개구리 X의 살아있는 올챙이에서 정상 적이고 변경 된 분자 신호로 광학 축색 아버를 표현하는 개별 GFP를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. . 라에비스. 우리는 또한 생체 내에서 캡처 한 이미지에서 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 형태를 재구성하고 정량화하는 방법에 대해설명합니다. 소수의 광학 뉴런…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리의 연구를 지원하기위한 정골 의학의 투로 대학 캘리포니아 대학 감사합니다. 우리는 우리 실험실에서이 미세 주입 기술을 구현하는 데 도움을 준 실험실 (에스더 우, 그레고리 펭, 진 태건 진, 존 림)의 이전 학생들을 인정합니다. 제노푸스 배아의 이 DNA 미세 주사/지질 검사 기술이 처음 개발된 크리스틴 홀트 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
Referenzen
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
