TNBS媒介性腸線維症の発症に関する機械的洞察とラパマイシンの阻害効果の評価

この原稿では、すべてのヒトサンプルは、研究所レビュー委員会(IRB)およびアルバニー医科大学の人間研究委員会によって承認されたプロトコルに従って調達されました。動物に関するすべての研究は、アルバニー医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会と、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドによって承認されたプロトコルに従って厳密に行われました。. 1. ヒト腸標本の採取 機関の研究委員会のプロトコルに従ってヒト組織サンプルを収集します。 線維症と診断されたCD患者の腸組織(イレオコロニック)を調達し、IBDの既往歴のない患者からサンプルをコントロールする。 免疫組織学のための腸組織の一部、mRNAを分析するための組織の別の部分、および線維性およびサイトカイン遺伝子/マーカーのタンパク質発現のための最終部分を使用します。 免疫組織学分析では、まず少なくとも48時間の4%パラホルムアルデヒドでヒト組織サンプルを固定し、少なくとも16時間70%エタノールを含むチューブに移します。組織マイクロトームを使用してセクション。 ブラシを使用して、染色用のガラススライド上の各カットセクションを静かに広げます。 コラーゲン沈着を検出するためにトリクロム染色を用いた染色組織セクションスライド、およびαSMA染色で筋線維芽細胞を検出する(トリクロムおよびαSMA染色に関する詳細については、セクション3を参照)。光顕微鏡で染色された部分を調べます。 得られたヒト組織サンプルの別の部分を処理して、タンパク質をライサートして、ウェスタンブロットを介してαSMAを検出します(ウェスタンブロット分析の詳細については、セクション7を参照してください)。 抽出試薬(材料の表)を使用してヒト組織サンプルの最終部分からRNAを取得し、RT-PCRを介してcRNAをcDNAに変換します。 qPCRによって線維性およびサイトカイン遺伝子を分析する(mRNA製剤の詳細についてはセクション6を参照)。 2. マウスにおけるTNBS線維症およびラパマイシン治療の誘導 機関によって承認された動物研究プロトコルに従って動物研究を行う。 真皮暴露を介してTNBSに事前感光するために首の周りに成体マウスを剃る。綿棒にTNBSを浸し、マウスの首の剃毛領域にTNBSを適用します。注:プレ感光は、TNBS媒介性炎症を開始するために遅延過敏応答を改善するので、非常に重要なステップです。 8日目の感化後、直腸内投与により大腸炎を6週間にわたり6週間誘導する。3.5フランスのポリウレタンカテーテルに取り付けられた1mLシリンジを介して100 μL浣腸を用いて4mgのTNBS(25%エタノール)を塗布し、25%エタノールのみの対照マウスに100μLを与える。 ペントバルビタール(25mg/kgの精米腔内)でマウスを麻酔するか、TNBS投与中に酸素の1 L/minと共に2.5%のイソフルランにさらします。つま先をそっとつまみ、反射がないか探して麻酔を確認します。 マウスが麻酔下にある間、乾燥を防ぐために目に獣医の歯を使用してください。 ラパマイシンを2mg/kg/日または車両(5%Tween-20および4%エタノール)で平日3〜6週間、経皮内、コントロールおよびTNBS処理マウスの両方に注入する。 組織学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティングおよびRNA抽出を含む細胞外アッセイを分析するために6週間のTNBS後処理マウス腸を使用してください。臓器を収穫するには、CO2吸入を用いてマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼で安楽死を確認する。 臓器を収穫するには、CO2吸入を用いてマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼で安楽死を確認する。安楽死後、外科グレードのはさみと鉗子を使用して、その腹部側のマウスを縦方向に開きます。直腸から末端イリウム領域に結腸全体を取り除きます。コロンを氷冷1x HBSSに素早く移し、同じバッファーを使用してコロンを洗浄します。 対照およびTNBS処理マウスの結腸長を測定および比較する。細胞死を避けるために、コロンから乾燥を避けるために、できるだけ速くこの手順を行います。 コロンを小片に切り、将来の目的のために-80 °Cに保ちます(RNA/ウェスタンブロット分析)。FACS 分析には、コロンの別の部分を使用します。 コントロールとTNBS処理動物の両方の結腸の類似した領域から大腸組織サンプルを切断し、収集してください。注:TNBS接種では10%~20%の死亡率が期待されますが、経験を積んで死亡率を大幅に低下させることができます。 3. 腸線維症の免疫組織病理学的評価 ヒトおよび/またはマウスの組織を4%パラホルムアルデヒドで48時間固定し、16時間70%エタノールに移します。注:パラホルムアルデヒドは神経毒性の化学物質ですので、吸入を避ける;フェイスマスクを使用する場合。 パラフィンは、固定大腸組織を埋め込み、5 μmの厚さにスライスし、組織学のためのガラススライドに直接組織を置きます。 コラーゲンを検出するメーカーの指示に従ってH&Eとトリクロムブルーの染色を行います。 簡単に言えば、最初に各チャンバーで5分間キシレンの2つのチャンバーにセクションを含むスライドを水没させて断面を脱パラフィン化する。 100%アルコールでスライドを1分間すすいで下す。この手順を 3 回繰り返します。水道水でもう一度1分間すすいでください。 その後、56°Cで予熱されたBouinの溶液に60分間スライドを浸す. ブインの溶液は外観が黄色です。Bouinの溶液からスライドを水道水で3分間、またはスライドが無色になるまで洗います。 変更されたメイヤーのヘマトキシリン溶液に7分間、室温でスライドを浸します。 5-8分間トリクロム染色に浸漬することにより、スライディングスライドを5〜10sの流水ですすいで、余分なトリクロム汚れを除去します。 100%アルコールでスライドを1分間脱水し、この手順を3回繰り返します。 1分間キシレンでスライドをクリアし、ステップ3xを繰り返します。 取り付けメディア付きスライド(材料のテーブル)を取り付けます。 鉗子で一方の端にカバースリップを慎重に保持し、気泡を持たずにセクション全体をカバーします。いくつかの気泡がある場合は、カバースリップをタップしてすぐに気泡を削除します。 免疫染色を使用してαSMAを検出します。 ブロックバッファー内の大腸切片(0.2%トリトンX-100および5%正常なヤギ血清1x PBS)を室温で1時間ブロックする。 スライド溶液上のαSMA(材料表)用希釈一次抗体の100μLを100μLでインキュベートし(1x PBSで0.2%トリトンX-100および3%正常ヤギ血清、抗αSMA 1:200)を一晩4°Cでインキュベートする。 1x PBSでセクションを3回洗います。 ヤギの抗マウスIgG(H +L)をAlexa Fluor 488(材料の表)と共役に使用し、室温で2時間の二次抗体として使用します。 1x PBSでセクションを3回洗います。 DAPI を使用して、5 分間核を反染します。 1x PBSでセクションを3回洗います。 蛍光取り付け媒体(材料の表)が付いているスライドを取付け、マニキュアを使用してカバースリップとシールする。 LSM 880共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、顕微鏡ソフトウェアを用いて画像を処理します。 ImageJ と同じセクションで複数の選択した領域の平均を取り込んで画像を定量化します。 4. 腸内線体プロプリの分離とCx3Cr1+単核性ファゴサイトの精製 氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS;材料の表)同じバッファーでコロンを洗浄します。 HBSSの無菌はさみを使用して、約5cmの小さな大腸組織を切ります。 消化前バッファーの10 mLを含む50 mL円錐管に小さな大腸組織片を移管し(5S、5mM EDTAおよび1 mM DTTTを有する1x HBSS)、および37°Cインキュベーター11で100rpmで20分間振る。注:100rpmの揺れ条件で37°Cの大腸組織のインキュベーションは、効率的なコラゲナーゼ組織の消化と生存細胞の高収率を可能にします。 40 μmの細胞ストレーナーを通過することにより、切り離された大腸上皮を破棄します。 ストレーナーから残りの組織を回収し、100rpmで37°Cで20分間5Sで1x HBSSでコラーゲナーゼタイプIVおよびDNase I(材料の表)を含む消化バッファーでそれらをさらに消化します。 約20秒の消化組織を渦にし、40μmの細胞ストレーナーを通過して、ラミナプロプリリア画分を得る。 4°Cで700 x gで細胞をペレットにするラミナプロプリリア画を遠心分離 ラミナプロプリアから死んだ細胞を除外するには、密度勾配(材料の表)を使用します。注:ここで使用される密度勾配媒体(材料の表)は、単核細胞の損失を引き起こす可能性があります。しかし、それは全体的に純度を増加させる調製物から死んだ細胞を大幅に除去します。 30% および 70% の密度グラデーション メディア ソリューションをそれぞれ 100 mL にします。得られた細胞を30%溶液の10mLで再懸濁し、15mLチューブで70%溶液の5mLの上にオーバーレイする。 ブレーキのない状態で勾配を 1,000 x gと室温で遠心分離します。30%と70%の勾配層の間になるラミナプロプリアリンパ球を含む白色リング相を収集します。 得られた細胞を500xg、20°C、FACS(蛍光活性化細胞選別)バッファー(PBS、pH 7.4、1%BSAおよび2mM EDTA)で10分間再中断して、氷冷HBSSおよび遠心分離機で再中断して洗浄する。 磁気ビーズやFACS選別を用いて、採取した細胞精製から単核性ファゴサイトを精製します。 磁気精製 抗体による染色に先立ち、氷上で15分間抗マウスCD16/CD32 Fc遮断薬でインキュベートすることにより、ラミナプロプリア細胞の細胞表面をブロックする。 抗Cx3Cr1-PE(フィコエリスリン)抗体と抗PEマイクロビーズ(材料表)を氷上で30分間インキュベートし、結合細胞を捕捉する。FACSバッファでセルを洗浄します。 磁場内の磁気活性化細胞選別カラムを通して抗体/ビーズ結合細胞を通過させ、結合のない細胞を除去します。FACSバッファで3回洗浄します。磁場からカラムを取り外し、カラム内のプランジャーを押してビーズ結合セルを生成します。 FACS の並べ替え注:FACSの選別は磁気精製の代わりに使用することができる。磁気精製は簡単で費用対効果の高い方法ですが、細胞の亜集団ではなく、単一の細胞を精製することに限定されます。したがって、細胞の亜集団を単離するために、FACSソート法は、単一細胞ならびに細胞の亜集団をソートする効果的な方法である。 抗マウスCD16/CD32 Fcブロッカー(材料表)でラミナプロプリア細胞をブロックします。 抗CD64、CD11c、CD11b、Cx3Cr1、Ly6C、およびMHCII抗体をインキュベートして細胞を染色する。 FACSフローサイトメーターを使用してソートし、CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- CX3Cr1(P3 + P4)母集団を精製するセル。 溶解細胞を全RNA調製し、サイトカインおよび線維マーカーを検出する(RNAおよびcDNA調製についてはセクション6を参照)。 磁気精製から単一細胞懸濁液から線維マーカーおよび炎症性サイトカイン分析のmRNA発現を分析する。 FACS分析では、表面または細胞内マーカーに対する抗体で染色する前に、抗マウスCD16/CD32 Fc遮断薬(材料表)で細胞をブロックします。 5. フローサイトメトリー分析 細胞表面染色と分析 5-10×105 FACSバッファーの50mLで単離されたラミナプロプリア細胞を再中断する(1%BSA、PBSで2mM EDTA、pH 7.4)。 抗マウスCD16/CD32(材料表)で細胞を1:50希釈して、氷上のFc受容体を10分間遮断します。 500 μLの氷冷FACSバッファーで細胞を洗浄し、細胞表面染色の前に非結合抗CD16/CD32を除去します。 表面染色大腸単細胞懸濁液(106細胞/50mL)を蛍光標識抗体で1:100希釈した氷上で30分間希釈し、コロニー性ラミナプロプリアを評価した。 500 μLの氷冷FACSバッファーで標識された細胞を2回洗浄し、結合されていない抗体を除去します。 フローサイトメトリーにより標識された単核細胞を分析します。ライブ用ゲート、FSC+SSC+その後に CD11b+ Cx3Cr1+が続き、MHCII、CD80、CD86、CD40 を含む他のマクロファージアクティベーション マーカーを分析します。 細胞内サイトカイン染色と分析 細胞内サイトカイン染色の場合は、固定/透過化ソリューションキット(材料の表)を使用して表面染色細胞を固定し、透過化します。詳細な手順については、製造元の指示に従ってください。 ライブのためのゲートラミナプロプリア細胞、その後、FSC+SSC+続いてCD11b+ Cx3Cr1+IL23 + IL23+ IL11b+ Cx3Cr1+IL1β+IL1βサイトカインの細胞内レベルを検出する。 αSMA染色と分析 200 x gと4 °Cで5分間遠心分離してFACSバッファーで細胞を2回洗浄し、余分な固定バッファーを除去します。 αSMAレベルを決定するには、固定/透過化ソリューションキット(材料の表)で細胞を透過します。 抗αSMA-AF488抗体(材料表)を用いて細胞を30分間氷上で1:1,000希釈してインキュベートします。 細胞を2回洗浄し、FACS分析を行います。ライブ用ゲート、FSC+SSC+に続いて、結腸細胞におけるαSMA+細胞の検出が続く。 6. RNA絶縁、RT-PCR、リアルタイムPCR 抽出試薬(材料の表)でそれらを均質化することにより、MACSまたはFACS精製細胞または大腸切除組織からRNAを分離する。注:肺および皮膚刺激性であるこの試薬を使用する場合は、安全ゴーグルおよびその他のラボ保護具を使用してください。フードの中で安全に作業してください。 イソプロパノールでRNAを沈殿させる前に、20 μg/mLグリコーゲンストック溶液(材料表)からRNaseフリーグリコーゲンの0.5 μLを添加します。 RNAペレットを50μLのRNase自由水(材料表)で再濁し、55°Cで5分間インキュベートし、RNA口蓋を完全に溶解させます。 260 nmの分光光度計を使用してRNA濃度を読み取ります。 総RNAの1μgと逆転転写合成キット(材料の表)を用いてcDNAを合成する。 2μLのcDNAをリアルタイムPCRを用いて遺伝子発現を解析する。96ウェルPCRプレートqPCRマスターミックスキット(材料の表)を使用してください。CT 値を使用して、GAPDH/HPRT 値を正規化した後の RNA の倍率変化を計算します。 7. 西洋ブロッティング RIPAリシスバッファー(1%NP40)を用いて大腸組織をライスする。 8%のビストリスゲルでタンパク質リサートを80Vの一定電圧で解決します。 ゲルタンパク質をニトロセルロース膜に移し、4°Cで2時間50mAの定電流で走るコールドトランスファーバッファーに移す。 TBST(25 mMトリス-HCl、pH 7.4、1.5 M NaCl、0.05%トゥエン-20)を室温で少なくとも1時間の間、5%の非脂肪乳を使用してタンパク質転移膜上の非特異的領域をブロックします。 αSMAレベルを検出するには、一晩4°CでαSMA一次検出抗体を用いて膜をインキュベートする。 15分間隔でTBSTを使用して膜を3〜4回洗浄する。 TBSTの5%非脂肪乳でHRP結合二次抗体(1:10,000)でインキュベートします。 ECL開発キットを用いて膜を開発する。 密度分析の負荷制御としてGAPDHを用いるタンパク質信号強度を正規化する。 8. 統計分析 野生の種類とKO動物を比較して、選択したデータ解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。 P 値 <0.05 を有意なものと考えてください (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)。 学生のt検定を使用して、2つのグループと分散分析の違いをテストし、2つ以上のグループ間の分析を行います。