Summary

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

Published: September 07, 2019
doi:

Summary

Hier stellen wir ein mechanisches Dissoziationsprotokoll vor, um Makrophagen aus dem dorsalen Wurzelganglien für Phänotypisierung und funktionelle Analyse schnell zu isolieren.

Abstract

Es gibt wachsendes Interesse, die molekularen und zellulären Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und sensorischen Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien nach peripheren Nervenverletzungen zu untersuchen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich Makrophagen, sind dafür bekannt, auf eine Gewebeverletzung durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Neue Beweise haben den Beitrag von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen zur neuropathische Schmerzentwicklung und axonale Reparatur im Zusammenhang mit Nervenverletzungen impliziert. Schnell phänotypisieren (oder “schnelle Isolierung von”) die Reaktion von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen im Zusammenhang mit Nervenverletzungen ist gewünscht, um die unbekannten Neuroimmunfaktoren zu identifizieren. Hier zeigen wir, wie unser Labor Makrophagen aus den dorsalen Wurzelganglien mithilfe eines enzymfreien mechanischen Dissoziationsprotokolls schnell und effektiv isoliert. Die Proben werden durchweg auf Eis gehalten, um den zellulären Stress zu begrenzen. Dieses Protokoll ist im Vergleich zum standardenzymatischen Protokoll weit weniger zeitaufwändig und wurde routinemäßig für unsere fluorescence-aktivierte Zellsortierungsanalyse verwendet.

Introduction

Es gibt inzwischen erhebliche Hinweise darauf, dass Immunzellen zu den neuropathischen Schmerzen nach der peripheren Nervenverletzung1,2beitragen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich reifer Makrophagen, sind dafür bekannt, auf Gewebeverletzungen und systemische Infektionen durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Parallel zur nervenverletzungsinduzierten Mikroglia-Aktivierung im Spinaldorsalhorn dehnen sich Makrophagen in den Dorsalwurzelganglien (DRG) auch nach einer Nervenverletzung deutlich aus3,4. Insbesondere gibt es wachsendes Interesse zu bestimmen, ob Makrophagen zur neuropathisigen Schmerzentwicklung nach peripheren Nervenverletzungen beitragen, indem sie mit sensorischen Neuronen in der DRG5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11. Darüber hinaus implizieren neuere Studien auch den Beitrag von DRG-Makrophagen bei der axonalen Reparatur nach Nervenverletzungen12,13. Eine weitere Studie legt ferner nahe, dass Makrophagensubpopulationen (d. h. CD11b+Ly6Chi und CD11b+Ly6CLow/- Zellen) eine andere Rolle bei der mechanischen Überempfindlichkeit14spielen können. Daher kann eine schnelle Phänotypisierung der Reaktion von DRG-Makrophagen im Zusammenhang mit Einer Nervenschädigung uns helfen, Neuroimmunfaktoren zu identifizieren, die zu neuropathische Schmerzen beitragen.

Üblicherweise umfasst das Protokoll zur Isolierung von Makrophagen in der DRG mehrere Schritte, einschließlich der enzymatischen Verdauung15,16. Die Technik ist oft zeitaufwändig und kann für groß angelegte Experimente teuer werden. Obwohl eine milde Verdauung mit Kollagenase Typ II (4 mg/ml) und Dispase Typ II (4,7 mg/ml) für 20 min zuvor15empfohlen wurde, ist es denkbar, dass Zellen nach der Exposition gegenüber diesem Enzym anfällig für Zellschäden oder Zelltod sind, was zu aufgeben. Darüber hinaus kann der Unterschied in der Qualität der Enzyme von Charge zu Charge die Effizienz dieses Prozesses weiter beeinflussen. Noch wichtiger ist, dass Makrophagen, die der Enzymverdauung ausgesetzt sind, unerwünscht stimuliert werden und sich somit sehr vom In-vivo-Status unterscheiden können. Die Änderungen können das Ergebnis der funktionellen Studie möglicherweise erschweren.

Hier beschreiben wir ein enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung von DRG-Makrophagen bei 4 °C mittels mechanischer Dissoziation. Die Proben werden auf Eis gehalten, um zellulären Stress zu begrenzen. Infolgedessen bietet unser Ansatz einen Vorteil, um die Konsistenz der Isolierung aufrechtzuerhalten, und die isolierten Zellen sind vermutlich gesünder und weniger stimuliert. Wir stellen außerdem den Nachweis vor, die Qualität der isolierten Zellen mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zu validieren.

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California San Francisco genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. 1. Sammeln Lenden wirbeln DRG von experimentellen Mäusen Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums (z.B. Percoll) vor, indem Sie 9 Volumen des Mediums mit 1 Volumen ca++/Mg++ -frei10…

Representative Results

Um die isolierten Zellen zu validieren, wählten wir zuerst die Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA) transgene Mäuse17. Diese Linie drückt ein medikamentös induzierbares FK506-bindendes Protein (FKBP)-Fas Selbstmordfusionsgen und grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) unter der Kontrolle des Promotors des CSF1-Rezeptors (CSF1R) aus, der sich sowohl in Makrophagen als auch in Mikroglia spezifisch äußert. Die systemische Injektion des FK-bindenden Proteindimeris, AP20187 (AP), induziert di…

Discussion

Hier stellen wir eine neue Methode vor, um isolierte Makrophagen aus Maus-DRG effektiv anzureichern. Der konventionelle Ansatz, DRG-Immunzellen zu isolieren, erfordert eine enzymatische Verdauung15,18, die nun durch mechanische Homogenisierung in unserem Protokoll ersetzt wird, um unerwünschte Zellschäden zu begrenzen und die Ausbeute zu erhöhen. Daher ist das neue Protokoll weit weniger zeitaufwändig. Noch wichtiger ist, dass die Enzymverdauung die Makrophag…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Studie wurde unterstützt von: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); die UCSF-Abteilung für Anästhesie und Perioperative Versorgung (XY); und 1R01NS100801-01(GZ). Diese Studie wurde teilweise von der HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility durch ein Stipendium des NIH (P30CA082103) unterstützt.

Materials

AP20187 Clontech 635058
a-mouse CX3CR1-APC antibody Biolegend 149007
Avertin Sigma T48402
Cell strainer (70 mm nylon) Falcon 352350
Centrifuge Eppendorf 5810R
Dounce tissue homogenizer Wheaton 357538 (1ml)
FACS tubes (5ml) Falcon 352052
Friedman-Pearson Rongeur FST 16121-14
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) Gibco 14185-052
Noyes Spring Scissor FST 15012-12
Percoll Sigma P4937-500ml
Propidium iodide Sigma P4864-10ml

Referenzen

  1. Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
  3. Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
  4. Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
  5. Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
  6. Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
  7. Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
  8. Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
  9. Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
  10. Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
  11. Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
  12. Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
  13. Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
  14. Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
  15. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
  16. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
  17. Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
  18. Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
  19. Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  20. Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Yu, X., Leff, J., Guan, Z. Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages. J. Vis. Exp. (151), e60023, doi:10.3791/60023 (2019).

View Video