Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi
Summary
Bu makalede, Genomlarda Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (HRM) tabanlı Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING) olarak tanımlanan protokolü satılmaktadır. Bu yöntem, DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerini kullanır ve hem ekleme/silme (Indel) hem de tek baz ikamesi (SBS) yüksek işlem li tarama için uygundur.
Abstract
Genomlarda Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING), indüklenen mutasyonların yüksek iş lenme taraması için ters genetik stratejisidir. Ancak TILLING sistemi ekleme/silme (Indel) tespiti için daha az uygulanabilirliğe sahiptir ve geleneksel TILLING’in CEL I nükleaz sindirimi ve jel elektroforez gibi daha karmaşık adımlara ihtiyacı vardır. Verim ve seçim verimliliğini artırmak ve hem Indels hem de tek baz ikamelerinin (SBSs) taranmasını mümkün kılmak için, yeni bir yüksek çözünürlüklü erime (HRM) tabanlı TILLING sistemi geliştirilmiştir. Burada ayrıntılı bir HRM-TILLING protokolü sunmakta ve mutasyon taramasında uygulamamızı gösteriyoruz. Bu yöntem, yüksek sıcaklıklarda çift iplikli DNA denatürasyonu ölçerek PCR amplicons mutasyonları analiz edebilirsiniz. HRM analizi ek işleme gerek kalmadan doğrudan PCR sonrası gerçekleştirilir. Ayrıca, basit, güvenli ve hızlı (SSF) DNA çıkarma yöntemi HEM Indels ve SBSs tanımlamak için HRM-TILLING ile entegre edilmiştir. Sadeliği, sağlamlığı ve yüksek iş kalitesi, pirinç ve diğer ürünlerde mutasyon taraması için potansiyel olarak yararlı olmasını sağlayabilir.
Introduction
Mutantlar bitki fonksiyonel genomik araştırma ve yeni çeşitlerin ıslahı için önemli genetik kaynaklardır. İleri genetik yaklaşım (yani mutant seçiminden gen klonlama veya çeşitli gelişime kadar) yaklaşık 20 yıl önce indüklenen mutasyonların kullanımında ana ve tek yöntem olarak kullanılmıştır. McCallum ve ark.1 tarafından yeni bir ters genetik yöntemi, TILLING (Hedefleme Kaynaklı Lokal Lezyonlar Genomlar) gelişimi yeni bir paradigma açıldı ve o zamandan beri hayvan ve bitki türlerinin çok sayıda uygulanmıştır2. TILLING özellikle teknik olarak zor veya maliyetli olan (örneğin, hastalık direnci, mineral içeriği) üreme özellikleri için yararlıdır.
TILLING başlangıçta kimyasal mutajenler tarafından indüklenen tarama noktası mutasyonları için geliştirilmiştir (örn. EMS1,3). Aşağıdaki adımları içerir: bir TILLING nüfus (lar) kurulması; DNA hazırlama ve bireysel bitkilerin havuzlanması; Hedef DNA parçasının PCR amplifikasyonu; PCR amplikonve dekoltesinin CEL I nükleaz tarafından denatürasyonu ve tavallanması ile heteroduplexes oluşumu; ve mutant bireylerin ve spesifik moleküler lezyonların tanımlanması3,4. Ancak, bu yöntem hala nispeten karmaşık, zaman alıcı ve düşük iş için. Daha verimli ve daha yüksek iş ile yapmak için, silme TILLING (De-TILLING) ( Tablo1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerine dayanan HRM eğrisi analizi, mutasyon taraması ve genotipleme için basit, uygun maliyetli ve yüksek iş lenme yöntemidir13. HRM zaten yaygın Olarak EMS mutagenez 14 tarafından indüklenen SBS mutasyonları taranması için HRMtabanlı TILLING (HRM-TILLING) dahil olmak üzere bitki araştırmalarında kullanılmıştır. Burada, pirinçteki gama (γ) ışınları ile indüklenen mutasyonların (Hem Indel hem de SBS) taranması için ayrıntılı HRM-TILLING protokolleri sunduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING gen fonksiyonel analizi ve bitki ıslahı için indüklenen mutasyonları tanımlamak için güçlü bir ters genetik araç olduğunu kanıtlamıştır. Kolay gözlenmeyen veya belirlenemeyen bazı özellikler için, yüksek iş itrılişli PCR tabanlı mutasyon tespiti ile TILLING farklı genler için mutantlar elde etmek için yararlı bir yöntem olabilir. HRM-TILLING yöntemi mutasyon taraması için domates12,buğday11 ve üzüm20 EMS-mu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2016YFD0102103) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.31701394) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
Referenzen
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
