Identificando mutações por derretimento de alta resolução em uma população de lavando de arroz
Summary
Neste artigo, nós apresentamos o protocolo que é descrito como a análise de derretimento de alta resolução (HRM)-baseou as lesões locais induzidas alvo nos genomes (TILLING). Este método utiliza mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN e é apropriado para a seleção da elevado-produção da inserção/apagamento (Indel) e da única base cifras (SBS).
Abstract
As lesões locais induzidas alvo em genomes (TILLING) são uma estratégia da genética reversa para a seleção da elevado-produção de mutações induzidas. Entretanto, o sistema de TILLING tem menos aplicabilidade para a deteção da inserção/apagamento (Indel) e o TILLING tradicional precisa etapas mais complexas, como a digestão do nuclease do CEL I e a electroforese do gel. Para melhorar a eficiência da produção e da seleção, e para fazer a seleção dos indels e das Substitions de base únicas (SBSs) possíveis, um derretimento High-Resolution novo (HRM)-baseou o sistema de LAVRAMENTO é desenvolvido. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado de HRM-TILLING e mostramos sua aplicação na seleção da mutação. Este método pode analisar as mutações de amplicões do PCR medindo a desnaturação do ADN dobro-encalhado em altas temperaturas. A análise de HRM é executada diretamente borne-PCR sem processamento adicional. Além disso, um método simples, seguro e rápido da extração do ADN (SSF) é integrado com HRM-TILLING para identificar indels e SBSs. Sua simplicidade, robustez e alta taxa de transferência torná-lo potencialmente útil para a mutação de digitalização em arroz e outras culturas.
Introduction
Mutantes são importantes recursos genéticos para a pesquisa de genômica funcional de plantas e criação de novas variedades. Uma aproximação da genética para diante (isto é. da seleção do mutante ao clonagem do gene ou ao desenvolvimento da variedade) usou-se para ser o método principal e único para o uso de mutações induzidas aproximadamente 20 anos há. O desenvolvimento de um novo método de genética reversa, o TILLING (direcionamento de lesões locais induzidas em genomas) por McCallum et al.1 , abriu uma nova paradigma e desde então tem sido aplicado em um grande número de espécies de animais e plantas2. O TILLING é particularmente útil para as características de reprodução que são tecnicamente difíceis ou dispendiosas de serem determinadas (por exemplo, resistência a doenças, conteúdo mineral).
A lavagens foi inicialmente desenvolvida para as mutações do ponto de triagem induzidas por mutagénicos químicos (por exemplo, EMS1,3). Inclui as seguintes etapas: o estabelecimento de uma população (s) de TILLING; Preparação de DNA e agrupamento de plantas individuais; Amplificação do PCR do fragmento do ADN do alvo; formação de heteroduplexes por desnaturação e recozimento de amplicões e clivagem de PCR por nuclease de cel I; e identificação de indivíduos mutantes e suas lesões moleculares específicas3,4. No entanto, esse método ainda é relativamente complexo, demorado e de baixa taxa de transferência. Para torná-lo mais eficiente e com maior produtividade, muitos métodos de lavo modificados foram desenvolvidos, como o apagamento da lavagem (de-lavagem) (tabela 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
A análise da curva de HRM, que é baseada em mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN, é um método simples, cost-effective, e high-throughput para a seleção da mutação e genotipagem13. A HRM já foi amplamente utilizada na pesquisa vegetal, incluindo o TILLING baseado em HRM (HRM-TILLING) para a triagem das mutações do SBS induzidas pela mutagenese do EMS14. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados de HRM-TILLING para a seleção das mutações (Indel e SBS) induzidas por raios da gama (γ) no arroz.
Protocol
Representative Results
Discussion
O TILLING provou ser uma poderosa ferramenta genética reversa para identificar mutações induzidas para a análise funcional do gene e a criação de culturas. Para algumas características que não são facilmente observadas ou determinadas, a TILLING com detecção de mutação baseada em PCR de alta taxa de transferência pode ser um método útil para obter mutantes para diferentes genes. O método HRM-TILLING tem sido utilizado em populações EMS-mutagenizadas de tomate12, trigo<sup class=…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo programa-chave nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (no. 2016YFD0102103) e pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (no. 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
Referenzen
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
