Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst
Summary
In dit artikel presenteren we het protocol dat wordt beschreven als High-Resolution smelt analyse (HRM) gebaseerde doel geïnduceerde lokale laesies in Genomes (TILLING). Deze methode maakt gebruik van fluorescentie veranderingen tijdens het smelten van de DNA-duplex en is geschikt voor screening met hoge doorvoer van zowel inbrengen/deletie (Indel) als single base substition (SBS).
Abstract
Doelwit geïnduceerde lokale laesies in Genomes (TILLING) is een strategie van reverse genetics voor de screening met hoge doorvoer van geïnduceerde mutaties. Het kantelsysteem heeft echter minder toepasbaarheid voor het inbrengen/verwijderen (Indel) detectie en traditionele TILLING heeft meer complexe stappen nodig, zoals CEL I Nuclease spijsvertering en gel elektroforese. Om de doorvoer-en selectie-efficiëntie te verbeteren, en om de screening van zowel indels als enkelvoudige basis substitions (SBSs) mogelijk te maken, wordt een nieuw TILLING-systeem op basis van hoge resolutie (HRM) ontwikkeld. Hier presenteren wij een gedetailleerd HRM-TILLING protocol en tonen de toepassing in de mutatie screening. Deze methode kan de mutaties van PCR-amplicons analyseren door de denaturatie van dubbel gestrande DNA bij hoge temperaturen te meten. De HRM-analyse wordt direct na de PCR uitgevoerd zonder verdere verwerking. Bovendien is een eenvoudige, veilige en snelle (SSF) DNA-extractiemethode geïntegreerd met HRM-TILLING om zowel indels als SBSs te identificeren. De eenvoud, robuustheid en hoge doorvoer maken het mogelijk nuttig voor mutatiescanning in rijst en andere gewassen.
Introduction
Mutanten zijn belangrijke genetische hulpbronnen voor het functionele genomics-onderzoek en de kweek van nieuwe rassen. Een voorwaartse genetica benadering (d.w.z. van Mutante selectie tot genklonen of variété ontwikkeling) was vroeger de belangrijkste en enige methode voor het gebruik van geïnduceerde mutaties ongeveer 20 jaar geleden. De ontwikkeling van een roman reverse genetics methode, TILLING (gericht op geïnduceerde lokale laesies in Genomes) door McCallum et al.1 opende een nieuw paradigma en het is sindsdien toegepast in een groot aantal dier-en plantensoorten2. TILLING is vooral nuttig voor fokeigenschappen die technisch moeilijk of kostbaar zijn om te bepalen (bijv. ziekte resistentie, mineraalgehalte).
TILLING werd oorspronkelijk ontwikkeld voor screening puntmutaties geïnduceerd door chemische mutagene agentia (bv. EMS1,3). Het omvat de volgende stappen: de oprichting van een TILLING populatie (s); DNA-bereiding en bundeling van individuele planten; PCR-versterking van doelwit DNA-fragment; heteroduplexen vorming door denaturatie en gloeien van PCR-amplicons en decolleté door CEL I Nuclease; en identificatie van mutant individuen en hun specifieke moleculaire laesies3,4. Deze methode is echter nog steeds relatief complex, tijdrovend en lage doorvoer. Om het efficiënter en met een hogere doorvoer te maken, zijn veel gemodificeerde kantel methoden ontwikkeld, zoals het verwijderen van de TILLING (de-Tilling) (tabel 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
De HRM-curve analyse, die is gebaseerd op fluorescentie veranderingen tijdens het smelten van de DNA-duplex, is een eenvoudige, kosteneffectieve en hoge doorvoer methode voor mutatie screening en genotypering13. HRM is al op grote schaal gebruikt in planten onderzoek, waaronder op HRM gebaseerde TILLING (HRM-TILLING) voor het screenen van SBS-mutaties geïnduceerd door EMS-mutagenese14. Hier presenteerden we gedetailleerde HRM-TILLING protocollen voor het screenen van mutaties (zowel Indel als SBS) geïnduceerd door gamma (γ) stralen in rijst.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING is een krachtig reverse-genetisch hulpmiddel gebleken voor het identificeren van geïnduceerde mutaties voor genfunctionele analyse en gewas veredeling. Voor sommige eigenschappen die niet gemakkelijk worden waargenomen of bepaald, kan het KANTELEN met PCR-gebaseerde mutatie detectie met hoge doorvoer een nuttige methode zijn om mutanten voor verschillende genen te verkrijgen. De HRM-TILLING methode is gebruikt in EMS-mutageen populaties van tomaat12, tarwe11 en Gra…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het National Key Research and Development Program van China (nr. 2016YFD0102103) en de National Natural Science Foundation of China (No. 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
Referenzen
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
