프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

질량 분석법 (MS)은 환원주의의 기술 실현이다; 분석 대상을 분자 종 또는 캐스케이드에 기초하여 해석할 수 있는 단위로 감소시킵니다. 따라서, 그것은 분석 화학의 대표적인 방법입니다. 이온화, 분석, 검출 및 스펙트럼 수집의 네 가지 프로세스로 구성됩니다. 분자의 이온화는 질량 분석법의 첫 번째 과정이기 때문에 일반적으로 처리될 분석물의 형태를 제한합니다. 대부분의 이온화 절차는 유기 시료의 구조, 형태학 및 실시간 생물학적 공정의 파괴를 요구합니다. 예를 들어, 전기 분무 이온화(ESI) MS는 효율적인 이온화를 위해 샘플이 액체 상태에 있어야 합니다^1. 따라서 샘플은 분자의 구성을 변경하는 복잡한 생화학 적 준비를 거쳐야합니다. 대안적으로, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) MS는 얇은 단면 조직^2,3의분자 맵을 재구성할 수 있지만, 이온화 효율이 너무 낮아 시료의 모든 분자를 검출할 수 없으며, 특히 지방산을 분석하는 데 는 좋지 않습니다. 이러한 한계를 고려하여, 프로브 전기분무 이온화(PESI)^4는 구조적^무결성을파괴하지 않고, 생물학적 유기체가 기술적으로 살아있는 상태에서 관찰되는 동안, 그 면에서 생물학적 시스템의 실시간 변화를 관찰하는데 사용될 수 있다. 매우 미세한 바늘은 샘플 피커와 이온 방출기로 동시에 작용하는 이 경우에 사용됩니다. 이것은 복잡한 견본 전처리 순서가 살아있는 시스템의 분자 분대를 반영하는 질량 스펙트럼을 장악하기 위하여 우회될 수 있다는 것을 의미합니다.

PESI-MS에 필적하는 몇 가지 다른 이온화 방법이 있습니다. 하나는 급속 증발 이온화 질량 분광법(REIMS)^6. 이 기술은 전기 칼로 조립하고 절개 중에 생성 된 이온 깃털을 수집하기 때문에 수술 중에 잘 작동합니다. REIMS는 수술에 매우 유용하지만, 본질적으로 조직의 전기 절제가 필요한 파괴적인 방법입니다. 따라서, 예비 샘플 또는 실험실 분석에서 세포 및 조직의 상세한 분석에 유용하지 않다. 또한, 조직 파편을 포함하는 많은 양의 깃털을 수집하기 때문에 매번 사용 후 장치의 긴 유지 보수가 필요하므로이 기계의 사용을 특별한 외과 적 수술로 제한합니다. 레이저 탈착 이온화 질량 분석법(LDI-MS)^7이라고하는 유사한 방법은 표면 분석에 비침습적이고 유용한 또 다른 기술입니다. 이 기술은 견본의 표면을 스캐닝에 좋기 때문에 MALDI 화상 진찰 질량 분광법^8,9와 같은 포괄적인 2차원 분석을 달성합니다. 그러나, LDI-MS는 표면 분석에만 적용가능하기 때문에, PESI-MS는 예를 들어, 조직 내에서 샘플을 분석하는데 유리하다. 또 다른 기술인 MasSpec Pen^10은갑상선암 진단에서 높은 특이성과 민감도를 달성하는 것으로 보고되었지만, 프로브의 직경은 mm의 순서이며 표면 분석에 특이적이며 암의 작은 결절이나 깊게 국한된 병변을 검출할 수 없다는 것을 의미합니다. 또한 이 방법은 프로브 펜에 내장된 미세 모세관 유관을 사용하므로 LDI-MS와 유사한 교차 오염을 고려해야 합니다. 유량 프로브 및 이온화 형태^{면봉(11)과}같은 임상 설정에 적용된 다른 기술이 존재하지만, 이들은 널리 퍼지지 않는다.

PESI는 ESI의 극단적 인 소형화이며, 여기서 나노 전기 스프레이의 모세관은 수백 nm의 팁 곡률 반경을 가진 고체 바늘에 수렴된다. 이온화는 테일러 콘을 형성하여 바늘 팁의 매우 제한된 영역에서 이루어지며, 이 때 샘플은 팁의 모든 유체의 이온화가 완료될 때까지^12. 금속 바늘의 끝에 있는 경우 금속 바늘과 타말물 사이의 계면에서 과량의 전하가 지속적으로 생성됩니다. 따라서 분자의 순차적 이온화는 표면 활성에 따라 발생합니다. 이 속성은 바늘 팁 크로마토 그램의 일종, 그들의 표면 활동에 따라 타액을 분리. 더 기술적으로, 더 강한 표면 활동을 가진 분자는 테일러 콘의 표면에 와서 이온화 과정이 끝날 때까지 바늘의 표면에 부착 약한 표면 활동을 가진 것보다 일찍 이온화된다. 따라서, 바늘에 의해 포착된 모든 분자의 완전한 이온화는^{13달성된다.} 더욱이, 이 기술은 샘플에 불필요한 용매를 첨가하지 않기 때문에, 수백 개의 펨토리터는 추가 분석을 위해 충분히 강한 질량 스펙트럼을 얻기에 충분하다^14. 이러한 특성은 손상되지 않은 생물학적 샘플의 분석에 유리하다. 그러나 PESI-MS의 주요 단점은 톱니 기계와 유사한 수직 축을 따라 바늘의 왕복 이동으로 인해 이온화의 불연속성에 있다. 이온화는 프로브의 팁이 이온 오리피스의 높이가 수평 축에 정렬될 때 가장 높은 지점에 도달할 때만 이루어집니다. 바늘이 샘플을 집어 들고 있는 동안 이온화가 중단되므로 이온화의 안정성은 기존 ESI와 동일하지 않습니다. 따라서 PESI-MS는 프로테오믹스에 이상적인 방법이 아닙니다.

현재까지 PESI-MS는 기초 연구에서 임상 설정에 이르는 광범위한 분야를 포괄하는 생물학적 시스템 분석에 주로 적용되었습니다. 예를 들어, 수술 동안 제조된 인간 조직의 직접 분석은 신장 세포 암종¹⁵ 및 인두 편평암종¹⁶모두에서 트리아실글리세롤의 축적을 나타낼 수 있었다. 이 방법은 또한 지질 단면도에 집중하기 위하여 혈액과 같은 액체 견본을 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 분자 토끼에 식이 변화 하는 동안 묘사 되었습니다.; 이 분자의 일부는 임상 진단을 위한 이 시스템의 높은 감도 및 유용성을 나타내는 실험의 초기 단계에서 감소했다고 보고되었다^17. 더욱이, 살아있는 동물에게 직접 적용하면 단 1박 만에 간장의 생화학적 변화가 검출되어^5. Zaitsu 등^18이 실험을 다시 검토⁵ 거의 같은 방법으로 간 대사 프로필을 분석, 안정성및 우리의 원래 방법의 재현성을 강화 결과. 더욱이, 우리는 이 기술을 사용하여 마우스에 있는 주변 비암성 간에서 암 조직을 구별할 수 있었습니다^19. 따라서, 이것은 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 설정에서 유용한 다목적 질량 분석 기법이다. 또 다른 관점에서 PESI 모듈은 마운팅 어탯치먼트를 조정하여 다양한 질량 분석기에 맞게 만들 수 있습니다. 이 짧은 기사에서는 살아있는 동물을 가진 응용 프로그램을 포함하여 응용 프로그램의 기본 및 예제(그림 1)를소개합니다⁵.

각 국가의 규정과 법률에 따라, 이 프로토콜의 일부는 각 기관의 기준을 충족하기 위해 개정될 필요가 있을 것이다. 살아있는 유기체에 적용은 살아있는 동물에 있는 조직 또는 기관에 있는 생화확적인 또는 신진 대사 변경을 제공할 수 있기 때문에 가장 흥미롭고 도전적입니다. 이 신청서는 야마나시 대학의 동물 관리 기관위원회의 승인을 받았지만, 2013 년⁵에서 동물 실험에 대한 규정의 최근 변화로 인해 또 다른 승인이 필요합니다. 따라서 실험 방식의 여러 가지 수정이 권장됩니다. 실험에서 얻어진 질량 스펙트럼에 관해서는, 각 측정 사이의 질량 스펙트럼의 변동을 고려하여, 뉴클레오티드 시퀀싱 커뮤니티에 공통적인 스펙트럼 정보 공유 시스템은 없다. 작업자가 바늘을 다룰 때 특히 바늘 홀더에서 바늘을 제거할 때 바늘을 처리해야 합니다. 바늘을 분리하기위한 특수 장치는이 목적을 위해 매우 유용합니다. PESI 모듈의 구획은 밀폐된 밀폐챔버이기 때문에, 지침에 따라 질량분석기를 조작하면 이온 깃털의 누설이 발생하지 않는다.