Este protocolo descreve uma configuração original que combina medições espectrais e fluorescência ao longo da vida para avaliar a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) entre sondas fluorescentes à base de rodamina e polímero de lignina diretamente em seções de plantas espessas.
Na biomassa lignocelulósica (LB), a atividade das enzimas é limitada pelo aparecimento de interações não específicas com a lignina durante o processo de hidrolise, que mantém enzimas longe de seu substrato. A caracterização dessas interações complexas é, portanto, um desafio em substratos complexos, como a LB. O método aqui mede as interações moleculares entre moléculas com marcação de fluorofofóbico e a lignina autofluorescente nativa, a ser revelada pela transferência de energia de ressonância förster (FRET). Ao contrário das medições de FRET em células vivas usando dois fluorofônicos exógenos, as medições de FRET em plantas que usam lignina não são triviais devido à sua complexa autofluorescência. Desenvolvemos um pipeline original de aquisição e análise com observação correlacionada de duas propriedades complementares de fluorescência: emissão de fluorescência e vida ao longo da vida. SFLIM (microscopia de imagem espectral e fluorescente ao longo da vida) fornece a quantificação dessas interações com alta sensibilidade, revelando diferentes níveis de interação entre biomoléculas e lignina.
A lignocelulose hidrolicada em açúcares mononóicos, como a glicose, requer enzimas. Sua atividade é conhecida por ser contida pelo estabelecimento de interações não específicas entre enzimas e lignina1,2, sendo este último um polímero hidrofóbico e um componente importante da lignocelulose3. Assim, medir quantitativamente tais interações diretamente na escala celular é um desafio que deve ser abordado para otimizar a atividade catalítica enzimática e a lignocelulose pré-tratamento4.
Förster (ou fluorescência) de transferência de energia de ressonância (FRET) medição é um método de escolha para assa biomoléculas interação in situ. Esta transferência de energia não radiativa pode ocorrer entre um doador e um fluorofiforre aceitante se cumprirem condições diferentes. O espectro de emissão de doadores deve sobrepor-se, pelo menos parcialmente, ao espectro de excitação dos aceitadores. A escolha dos fluoroforreos é, portanto, crucial para tais experimentos. Em seguida, a eficiência de transferência diminui com a sexta potência de sua distância5 e só ocorre se ambas as moléculas estão nas proximidades (normalmente na faixa de nanômetros). Outra contingência pode alterar a eficiência de transferência, como orientação dipolo-dipolo, mas são atenuadas se os flúoros tiverem flexibilidade.
O FRET pode ser medido por diferentes técnicas e descrições detalhadas podem ser encontradas na literatura6,7. Em resumo, os principais métodos dependem de: i) emissão sensibilizada em que a variação na fluorescência de emissão de aceitamento é seguida e fornece principalmente resultados qualitativos; ii) o retolix do acceptor em que a fluorescência da emissão do doador é medida antes e depois do photobleaching do aceitador (neste caso, umas estimativas mais precisas do FRET podem ser conseguidas mas exigem o poder forte do laser aplicado às amostras fixas); e iii) medida vitalícia que diminui para o doador na presença do aceitador. Este método requer instrumentos específicos e permite medições de interação precisas e sensíveis entre fluorofóforos. Considerando a medição do FRET entre sondas fluorescentes e lignocelulose, a principal dificuldade é que a lignocelulose não é um único fluoroffore bem caracterizado: tem uma forte autofluorescência nativa e espectrarally-wide, principalmente proveniente da lignina, e dependente de espécies de biomassa8,9.
Neste artigo, propomos um procedimento novo e original adaptado a seções de amostras de madeira/planta. Este método baseado em SFLIM abre o caminho para medições quantitativas de FRET entre sondas fluorescentes e lignina em amostras de lignocelulose nativas.
As medições de espectro de fluorescência e espectro de emissões de correlação permite combinar vantagens de ambos os métodos. De fato, as medições espectrais por si só carecem de sensibilidade e permanecem qualitativas. Por outro lado, a vida de fluorescência é o método de escolha para as medições quantitativas tradicionais de FRET, mas foi demonstrado que a autofluorescência da lignina poderia variar dependendo da composição da lignina e do ambiente16. Assim, as interações de lignina com um aceitador ou lignina mudanças estruturais não podem ser discriminadas, uma vez que ambos resultam em uma diminuição ao longo da vida. Como demonstrado, o método desenvolvido fornece a medida inequívoca, sensível e quantitativa das interações entre moléculas da lignina e do aceitador em seções da planta. Mesmo que as diferentes etapas do método tenham sido rigorosamente otimizadas, o cuidado deve ser particularmente tomado para os seguintes pontos.
Em relação às amostras, a qualidade da seção de plantas é fundamental para garantir imagens em foco. As etapas diferentes para peg incorporação devem ser rigorosamente seguidas. A etapa final da lavagem é essencial para garantir que não haja interferência do PEG restante nas amostras. Além disso, a concentração tampão e o pH devem ser mantidos estritamente idênticos para todas as medidas desde que toda a mudança pode ter um impacto forte em propriedades da fluorescência.
A medição da vida também pode ser delicada. A vida útil da fluorescência do doador pode ser instável, por exemplo por causa de uma alta excitação. Nesse caso, ajustar o poder do laser e o zoom pode corrigir o problema. Outra fonte bem conhecida de artefatos em medições TCSPC é o acúmulo de pulso de fótons. Na verdade, tcspc não pode medir a velocidade de dois fótons emitidos entre os mesmos dois pulsos de laser. Quando as amostras da planta forem estruturadas altamente, a fluorescência não é homogênea e pode conduzir a um efeito escondido do pileup do pulso. Embora o número de fótons por segundo permaneça abaixo do limite de excitação de 1%, pode ser maior em algumas áreas amostrais. Para garantir que não haja experimentos de engavetamento, a medição da vida de fluorescência do doador em um fluxo de fótons diferente pode ser considerada. Se a vida aumenta enquanto o fluxo diminui, um efeito pileup está alterando as medições. Fluxo de fótons ideal é alcançado com a estabilidade vitalícia do doador.
Em relação à análise da curva de decaimento sFLIM, recomendamos confiar em cada curva individual adequada para garantir que o modelo descreva com precisão as medições. Se não for o caso, primeiro garantir que nenhum dos artefatos mencionados anteriormente corromperam os dados. Em seguida, a etapa 2.1.4 fornece a função de resposta instrumental (IRF) do sistema. Se a IRF apresentar algumas anomalias, otimize o caminho óptico para minimizá-las. Um IRF medido para a montagem durante a etapa 6.2 pode igualmente ser usado. Finalmente, os graus de liberdade do modelo de montagem podem ser aumentados a uma deterioração três-exponencial na etapa 6.2. No entanto, o número de fótons necessários para a determinação individual de vida e proporção é alto e, portanto, é recomendado apenas usá-los para alcançar uma vida média mais estável a partir do passo 6.4. Informações mais exaustivas sobre a FLIM, sua caracterização18,sFLIM e sua aplicação12, nomeadamente à lignina10,podem ser encontradas na literatura.
Embora desafiador, a medida do FRET nos tecidos da planta usando o autofluorescence nativo mostra algumas vantagens. Em comparação com as medições de FRET realizadas em tecidos vivos em que os estudos de interação entre biomoléculas muitas vezes requer engenharia genética para expressar marcadores fluorescentes intrínsecos, tecidos vegetais dignificados como os apresentados aqui, oferecem autofluorescência, e extrínseco parceiro sondas fluorescentes podem ser facilmente adicionados, economizando muito tempo. No entanto, dependendo das espécies de plantas analisadas e de possíveis pré-tratamentos realizados, a autofluorescência provavelmente será modificada, de modo que ela precise ser cuidadosamente caracterizada e o fluorofifore usado como sondas pode precisar ser adaptado.
O método sFLIM deve ser aplicado a sondas fluorescentes sem atividade catalítica (PEG e dextran). No quadro da hidrólise da lignocelulose vegetal, foram realizadas interações de enzimas em várias amostras de biomassa, possivelmente resultando na determinação do impacto da localização (células e tecidos) na força de interação. A próxima etapa de otimização será a automação da etapa de análise. De fato, com dados analisados suficientes, um procedimento de análise baseado em aprendizado de máquina poderia ser implantado para análise automatizada do fenótipo, o que aumentaria sua comodidade para o rastreamento rápido de eficiência de biomassa de enzimas. Além disso, o sFLIM não requer fixação da amostra e pode ser facilmente aplicado a estudos dinâmicos de interação enzima-lignina. Tal método único é susceptível de orientar a estratégia de engenharia enzimática e pré-tratamento de biomassa para otimizar a valorização da lignocelulose.
The authors have nothing to disclose.
Fanny Laurent (FARE) é calorosamente agradecida pela preparação dos números. A Federação de Pesquisa FRABio (Universidade de Lille, CNRS) é reconhecida por fornecer o ambiente técnico propício para a realização deste trabalho. O financiamento foi obtido pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (PROJETO LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |