Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)

Dans les cellules, l’ARN existe dans le complexe avec des protéines pour former des complexes ARN:protéines (RNP). Les RRP sont assemblés autour de protéines liant l’ARN (RBPs, celles qui lient directement l’ARN) mais comprennent également des non-RRP (ceux qui lient les RRP mais pas l’ARN), et sont souvent de nature dynamique. Les RRP et leurs cofacteurs fonctionnent collectivement au sein des RNi pour exécuter des fonctions réglementaires. Par exemple, dans la voie de désintégration de l’ARNm médiée par l’absurdité (NMD), les protéines UPF (UPF1, UPF2 et UPF3b) reconnaissent le ribosome prématurément terminé. Chacune des protéines de l’UPF peut se lier à l’ARN, mais ce n’est que lorsqu’elles s’assemblent ensemble qu’un complexe actif de NMD commence à se former. Dans ce complexe, UPF1 est encore activé par la phosphorylation par un SMG1 non-RBP, et une telle activation UPF1 conduit finalement au recrutement de la désintégration de l’ARNm induisant des facteurs^1,2. Dans cet exemple, les RRP exigent des cofacteurs non-RBP pour le recrutement et l’activation du complexe RNP qui déclenche la MNM. Une autre propriété des RNP est leur hétérogénéité compositionnelle. Considérez le spliceosome, qui existe dans les complexes E, A, B ou C distincts. Différents complexes épiscédsome ont des protéines qui se chevauchent et des protéines distinctes³. Pour étudier les fonctions RNP, il est important d’élucider quels ARN sont liés par un RBP et ses protéines associées. De nombreuses méthodes existent pour y parvenir, chaque approche ayant ses avantages et inconvénients distincts^4,5,6,7.

Les méthodes très populaires pour identifier les sites de liaison RBP — liaisons croisées suivies par l’immunoprécipitation (CLIP) et ses diverses variations – s’appuient sur la lumière ultraviolette (UV) pour relier un RBP à l’ARN⁸. Cependant, ce n’est pas une approche efficace pour les non-RPP dans les RNP, qui ne contactent pas l’ARN directement. Ici, nous décrivons une approche alternative qui s’applique aux RRP et aux non-RPR, pour isoler et identifier leurs sites de liaison d’ARN. Cette approche appelée immunoprécipitation d’ARN en tandem (RIPiT) se compose de deux étapes d’immunoprécipitation, qui aident à atteindre une spécificité plus élevée par rapport à une seule purification (Figure 1)^9,10. Comme les étapes individuelles d’immunoprécipitation (IP) peuvent être effectuées à une chaîne inférieure par rapport à CLIP, RIPiT ne dépend pas de la disponibilité d’anticorps qui peuvent résister à la présence de détergents forts pendant l’immunoprécipitation. L’avantage le plus unique de RIPiT est la capacité de cibler deux protéines différentes en deux étapes de purification; ceci fournit un moyen puissant d’enrichir un complexe RNP compositionnellement distinct d’autres complexes similaires¹¹.

De petites variations à la procédure RIPiT peuvent encore améliorer l’enrichissement RNP. Par exemple, certaines interactions ARN-protéines ou protéines-protéines au sein des RNP sont transitoires et il peut être difficile de purifier efficacement les empreintes de ces complexes. Pour stabiliser de telles interactions, les RNR peuvent être reliés entre eux à l’intérieur des cellules avec du formaldéhyde avant la lyse cellulaire et le RIPiT. Par exemple, nous avons observé qu’une faible interaction entre le facteur de base du complexe de jonction d’exon (EJC), EIF4AIII et le facteur de désassemblage de l’EJC, PYM¹² peut être stabilisée avec un traitement au formaldéhyde de telle sorte que plus d’empreintes d’ARN sont enrichies (données non montré). Avant la récolte cellulaire et le RIPiT, les cellules peuvent également être traitées avec des médicaments pour stabiliser ou enrichir les RNi dans un état particulier. Par exemple, lors de l’étude des protéines qui sont retirées de l’ARNm pendant la traduction (p. ex., l’EJC¹³, UPF1¹⁴), le traitement avec des inhibiteurs de traduction tels que la puromycine, le cycloheximide ou la harringtonine peut entraîner une augmentation de l’occupation de protéines sur les ARN.

La quantité d’ARN récupérée dans le RIPiT est généralement faible (0,5-10 pmoles, c’est-à-d.- 10-250 ng ARN compte tenu d’une longueur moyenne d’ARN de 75 nt). La principale raison en est que seule une petite fraction d’une protéine donnée est présente en complexe avec d’autres protéines dans les RNP (toute protéine ip’ed “libre” dans la première étape est perdue au cours de la deuxième PI). Pour générer des bibliothèques RNA-Seq à partir de cet ARN, nous avons également décrit ici une adaptation du protocole précédemment publié adapté à ces faibles entrées d’ARN^15,16 (Figure 2), qui donne des échantillons prêts à sequencing à haut débit dans 3 Jours.