Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

Binnen cellen bestaat RNA in complex met eiwitten om RNA te vormen: eiwitcomplexen (RNPs). RNPs worden geassembleerd rond RNA bindende eiwitten (RBPs, die direct binden RNA) maar ook bestaan uit niet-RBPs (die binden RBPs maar niet RNA), en zijn vaak dynamisch van aard. RBPs en hun cofactoren functioneren collectief binnen RNPs om regelgevende functies uit te voeren. Bijvoorbeeld, in de nonsens-gemedieerde mRNA Decay (NMD)-pathway herkennen de UPF-eiwitten (UPF1, UPF2 en UPF3b) het voortijdig beëindigde ribosome. Elk van de UPF eiwitten kan binden aan RNA, maar het is pas wanneer ze samen assembleren dat een actief NMD-complex begint te vormen. Binnen dit complex wordt UPF1 verder geactiveerd door fosforylering door een niet-RBP SMG1, en een dergelijke UPF1 activering leidt uiteindelijk tot de werving van mRNA Decay inducerende factoren^1,2. In dit voorbeeld vereisen Rbp’s niet-RBP-cofactoren voor werving en activering van het RNP-complex dat NMD activeert. Nog een andere eigenschap van RNPs is hun compositorische heterogeniteit. Overweeg de spliceosome, die bestaat in verschillende E, A, B of C complexen. Verschillende spliceosoom complexen hebben overlappende en uitgesproken eiwitten³. Om RNP-functies te bestuderen, is het belangrijk om te verhelmaken welke Rna’s gebonden zijn aan een RBP en de bijbehorende eiwitten. Er zijn veel methoden om dit te bereiken, waarbij elke benadering zijn duidelijke voor-en nadelen heeft^4,5,6,7.

De meest populaire methoden om RBP binding sites te identificeren-crosslinking gevolgd door immunoprecipitatie (clip) en de verschillende variaties-vertrouw op ultraviolet (UV) licht om een RBP te crosslinken naar RNA⁸. Echter, dit is niet een effectieve aanpak voor niet-RBPs binnen RNPs, die niet rechtstreeks contact opnemen met het RNA. Hier beschrijven we een alternatieve aanpak die van toepassing is op Rbp’s en niet-RBPs, om hun RNA binding-sites te isoleren en te identificeren. Deze aanpak genoemd RNA-immunoprecipitatie in tandem (ripit) bestaat uit twee immunoprecipitatie-stappen, die helpen bij het bereiken van een hogere specificiteit in vergelijking met een enkele zuivering (Figuur 1)^9,10. Aangezien de individuele immunoprecipitatie (IP)-stappen met een lagere stringentie kunnen worden uitgevoerd in vergelijking met de clip, is ripit niet afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen die de aanwezigheid van sterke detergenten tijdens immunoprecipatie kunnen weerstaan. Het meest unieke voordeel van RIPiT is de mogelijkheid om twee verschillende eiwitten te targeten in twee zuiveringsstappen; Dit biedt een krachtige manier om een compositioneel verschillend RNP-complex van andere vergelijkbare complexen¹¹te verrijken.

Kleine variaties op de RIPiT-procedure kunnen de RNP-verrijking verder verbeteren. Sommige interacties van RNA-eiwit of eiwit-eiwit binnen RNPs zijn bijvoorbeeld van voorbijgaande aard en het kan moeilijk zijn om voetafdrukken van dergelijke complexen efficiënt te zuiveren. Om dergelijke interacties te stabiliseren, kan rnps worden gecrosslinkt in cellen met formaldehyde voorafgaand aan cel lysis en ripit. We hebben bijvoorbeeld geconstateerd dat een zwakke interactie tussen de kernfactor van Exon Junction (EJC), EIF4AIII en de disassemblage factor van EJC, PYM¹² kan worden gestabiliseerd met een formaldehyde-behandeling, zodat meer RNA-voetafdrukken worden verrijkt (gegevens niet weergegeven). Voorafgaand aan de celoogst en de RIPiT, cellen kunnen ook worden behandeld met drugs te stabiliseren of te verrijken RNPs in een bepaalde staat. Bijvoorbeeld, bij het bestuderen van eiwitten die worden verwijderd uit mRNA tijdens de vertaling (bijvoorbeeld, de EJC¹³, UPF1¹⁴), behandeling met Vertaal remmers zoals puromycine, haring of harringtonine kan leiden tot verhoogde bezetting van eiwitten op Rna’s.

De hoeveelheid RNA teruggewonnen uit RIPiT is meestal laag (0,5-10 pmollen, dat wil zeggen, 10-250 ng RNA gezien een gemiddelde RNA-lengte van 75 NT). De belangrijkste reden hiervoor is dat slechts een klein deel van een gegeven eiwit aanwezig is in complex met andere eiwitten binnen RNPs (elk “vrij” eiwit dat IP’ed in de eerste stap gaat verloren tijdens het tweede IP). Om RNA-SEQ-bibliotheken van dit RNA te genereren, schetsen we hier ook een aanpassing van het eerder gepubliceerde protocol dat geschikt is voor dergelijke lage RNA-ingangen^15,16 (Figuur 2), die een high-throughput sequencing voorbereide samples in 3 oplevert Dagen.