Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo

Le système moteur oculaire fournit un système élégant pour étudier les mécanismes de guidage des axones. Il est relativement simple, composé de trois nerfs crâniens intériorisant six muscles extraoculaires (EOM) qui déplacent l’œil, et le levator palpebrae superioris (LPS) qui soulève la paupière. Le nerf oculomoteur intémine les LPS et quatre EOM – les muscles inférieurs obliques et les muscles rectus médiaux, inférieurs et supérieurs. Les deux autres nerfs, le trochlear et les abducens, chacun seulement innervate un muscle, le muscle supérieur oblique et latéral de rectus, respectivement. Les mouvements des yeux fournissent une lecture facile, montrant si l’innervation était appropriée, manquante ou aberrante. En outre, il y a des désordres humains de mouvement d’oeil qui résultent des déficits dans le développement neuronal ou le guidage d’axone, collectivement appelé les désordres crâniens congénitaux de disinnervation (CCDDs)¹.

Malgré ces avantages, le système moteur oculaire est rarement utilisé dans les études de guidage d’axone^{2,3,4,5,6,7,8, 9} (en) ^{, 10}, en raison d’inconvénients techniques. Les tests de guidage d’axone in vitro ont beaucoup d’inconvénients¹¹. Les essais de co-culture, dans lesquels les explants neuronaux sont cultivés ensemble avec des explants de tissu cible¹² ou des cellules transfectées^13,dépendent à la fois de la symétrie de l’explantation et du positionnement précis entre l’explante et le tissu cible. Les essais à rayures^14,15, dans lesquels deux indices sont posés en rayures alternées et les axones sont évalués pour une croissance préférentielle sur une bande, indiquent seulement qu’un substrat est préférable à l’autre, non pas que l’un ou l’autre est attrayant répugnant, ou physiologiquement pertinent. Les chambres microfluidiques peuvent former des gradients chimiques précis, mais les axones de plus en plus de sujet pour cisailler le stress^16,17,18, qui peuvent affecter leur croissance. En outre, dans chacune de ces approches, la collecte d’explants ou de cellules dissociées exige que les axones de croissance soient axotomisés et donc ces essais examinent réellement la régénération d’axone, plutôt que la croissance initiale d’axone. Enfin, ces approches in vitro éliminent le microenvironnement qui influence les axones et leurs réponses aux indices le long de différents points de leur cours, et traditionnellement seulement tester un signal dans l’isolement. En plus de ces inconvénients, la petite taille de chaque noyau dans le système moteur oculaire rend la dissection techniquement difficile pour les explantations ou les cultures dissociées. En outre, les cultures primaires des neurones moteurs oculaires sont habituellement hétérogènes, ont la mort cellulaire significative, et sont dépendantes de densité, exigeant la mise en commun des cellules des embryons multiples (Ryosuki Fujiki, communication personnelle). Les méthodes in vivo, cependant, y compris les modèles de souris knock-out, sont inappropriés à utiliser pour le dépistage, compte tenu du temps et des dépenses requises.

Les méthodes développées pour la culture d’embryons entiers¹⁹ permettent l’étiquetage des cellules migratrices²⁰ ou le blocus de molécules spécifiques²¹, mais les cultures d’embryons entiers nécessitent l’incubation dans des bouteilles à rouleaux, ce qui empêche l’imagerie en temps réel de l’étiquetage Structures. Les techniques chirurgicales qui permettent la manipulation de l’embryon, puis le développement ultérieur soit dans l’utérus ou dans l’abdomen de la mère (maintien de la connexion placentaire)²² sont également possibles, mais ceux-ci ne permettent pas non plus time-lapse Imagerie.

Pour surmonter les obstacles des essais in vitro et permettre un dépistage rapide des voies de signalisation, une technique de culture de tranches embryonnaires ex vivo a été développée²³, adaptée d’un protocole précédemment publié pour la croissance nerveuse périphérique²⁴. Grâce à ce protocole, le nerf oculomoteur en développement peut être représenté au fil du temps en présence de nombreuses structures environnantes le long de sa trajectoire, y compris les cibles de l’OME. En ajoutant des inhibiteurs de petites molécules, des facteurs de croissance ou des indices de guidage aux médias de culture, nous pouvons évaluer les perturbations de guidage à plusieurs points le long de la trajectoire d’axone, permettant une évaluation plus rapide des facteurs de croissance et d’orientation potentiels.