Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes
Summary
Présenté ici est un protocole pour effectuer le temps et l’espace-limité gène knock-out dans les moelles épinières axolotl en injectant CAS9-gRNA complexe dans le canal central de la moelle épinière suivie d’électroporation.
Abstract
L’axolotl a la capacité unique de régénérer complètement sa moelle épinière. Ceci est en grande partie dû aux cellules éparméymales restant en tant que cellules souches neurales (NSCs) tout au long de la vie, qui prolifèrent pour réformer le tube éparmeymal et différencier en neurones perdus après des dommages de moelle épinière. Déchiffrer comment ces CNS conservent la pluripotence après le développement et prolifèrent sur les lésions de la moelle épinière pour réformer la structure exacte avant les blessures peut fournir un aperçu précieux sur la façon dont les moelles épinières mammifères peuvent se régénérer ainsi que les options de traitement potentielles. L’exécution de knock-outs génétiques dans des sous-ensembles spécifiques de NSC dans un délai limité permettra d’étudier les mécanismes moléculaires derrière ces processus régénérateurs, sans être confondus par le développement des effets perturbateurs. Décrit ici est une méthode pour effectuer le gène knock-out dans les NSC de moelle épinière d’axolotl utilisant le système CRISPR-Cas9. En injectant le complexe CAS9-gRNA dans le canal central de la moelle épinière suivi d’électroporation, les gènes cibles sont éliminés dans les CNS dans des régions spécifiques de la moelle épinière à un moment souhaité, ce qui permet des études moléculaires des CNS de la moelle épinière pendant régénération.
Introduction
La moelle épinière de la plupart des vertébrés est incapable de se régénérer à la suite d’une blessure, ce qui entraîne une invalidité permanente. Plusieurs salamandres, comme l’axolotl, sont des exceptions notables. L’axolotl peut régénérer complètement une moelle épinière structurellement identique et restaurer complètement la fonction de la moelle épinière. Une grande partie de la capacité régénératrice de la moelle épinière axolotl est due aux cellules éparméymales. Ces cellules tapissent le canal central, et contrairement à celles des mammifères, les cellules épargymales de l’axolotl restent en tant que cellules souches neurales (NSC) développement post-embryonnaire. Après une lésion de la moelle épinière (p. ex., à partir d’une amputation de la queue), ces CNS prolifèrent pour repousser le tube éparmeymalet et se différencier pour remplacer les neurones perdus1,2,3. Découvrir comment les CNS de la moelle épinière axolotl restent pluripotents et s’activent après une blessure peut fournir des informations précieuses sur l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients humains.
En raison des progrès de la technique DE knock-out du gène CRISPR-Cas9, l’exécution des knock-outs pour déchiffrer la fonction du gène est devenue plus facile et a été montrée pour avoir une large applicabilité dans diverses espèces, y compris les axolotls4,5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8. La publication récente du génome complet de l’axolotl et du transcriptome permet maintenant de cibler tout locus génomique et de mieux évaluer les effets hors cible9,10,11,12 , 13 (en) , 14. Des protocoles optimisés ont été développés pour les knock-out et knock-in en axolotls à l’aide du système CRISPR-Cas915. La livraison de la machinerie CRISPR-Cas9 sous forme de ribonucleoprotéine protéine-gRNA CAS9 (RNP) s’est avérée plus efficace que l’utilisation de Plasmides Cas9 et gRNA-encodage4. Ceci est probablement dû au RNP étant plus petit dans la taille que les vecteurs de plasmide, sa capacité à créer des ruptures d’ADN immédiatement, et protégeant de l’ARNc de la dégradation d’ARN. En outre, l’utilisation de rIN contourne la transcription et la traduction; ainsi, il évite des questions telles que la force de promoteur et l’utilisation optimale de codon quand les éléments de plasmide sont dérivés d’une espèce différente.
Les études sur la perte de fonction sont l’une des approches générales pour étudier les fonctions potentielles des gènes d’intérêt. Afin d’étudier la fonction génique pendant la régénération, un knock-out devrait idéalement être effectué juste avant une blessure pour éviter les effets sur le développement. En outre, le knock-out devrait être limité à la fois aux CNS et à la région de régénération. Un knock-out du gène cible dans tous les CNS (y compris ceux dans le cerveau, ce qui est le cas dans les systèmes Cre-LoxP), peut produire des effets non liés à la régénération qui peuvent confondre l’interprétation des résultats. Heureusement, la structure de la moelle épinière axolotl offre une occasion unique pour le temps et l’espace restreint knock-out dans les CNS. La plupart des NSC de la moelle épinière sont en contact avec le canal central et constituent la grande majorité des cellules en contact avec le canal central16,17. Par conséquent, une injection du complexe CAS9-gRNA dans le canal central, suivie de l’électroporation, permet l’administration aux CNS de la moelle épinière dans une région désirée à un moment précis4,18,19. Ce protocole démontre comment cela est effectué, menant à l’élimination très pénétrante dans les NSC ciblés de moelle épinière. L’analyse suivante est exécutée pour étudier les effets sur la régénération et le comportement de NSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit permet le temps et l’espace restreint gène knock-out dans les CNS dans la moelle épinière axolotl. Le protocole actuel permet un ciblage spécifique des CNS à un moment et à un endroit définis avec une forte pénétration. Il évite les effets indésirables potentiels provenant de l’élimination des gènes dans les CNS dans d’autres régions telles que le cerveau qui se produisent lors de l’utilisation du système Cre-LoxP. Il évite également les effets sur le développement provenant d’un kn…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le professeur Elly M. Tanaka pour son soutien continu et à long terme. Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) (317716), des subventions de recherche de départ de l’Université normale de Chine du Sud (S82111 et 8S0109), et une subvention de la China Postdoctoral Science Foundation (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referenzen
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