Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

1. Réactifs Lignes cellulaires (PSC humains) : obtenir des cellules souches embryonnaires (ESC) ou des lignes iPSC 409B2 et 201B7(317-9)) et CBA11. Préparation du réactif Milieu de placage PSC : mélanger le support d’entretien PSC avec 10 M Y-27632 et le stocker à 4 oC. PsC Sphéroïde carrelage moyen: mélanger le milieu d’entretien PSC avec 625-1,250 ng/mL recombinant humain Laminin-511 E8 fragment (LM511-E8)(selon la lignée cellulaire) juste avant l’utilisation.NOTE: LM511-E8 peut être mélangé dans les médias15. D’autres matrices telles que la laminin-511 pleine longueur doit être pré-enduit, et même fait ainsi, ils ne soutiennent pas les organoïdes mésodermales adhérés pendant le processus de différenciation. Moyen de différenciation du jour 0 : mélange zif de base mésodermal avec 2 M CHIR99021, 80 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et 80 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Moyen de différenciation du jour 2 : mélanger le milieu basal hémogénique avec 1 M SB431542, 80 ng/mL VEGF et 100 ng/mL facteur de cellules souches (SCF). Préparer le tampon de phosphate salin (PBS) sans calcium ou magnésium (Voir tableau des matériaux). 1 mM d’acide éthylèneminetétraacetic (EDTA) tampon: ajouter 1 mL de 0,5 M EDTA à 500 mL de PBS. EHT moyen: mélanger le milieu basal hématopoétique avec 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/Interleukin-6 alpha receptor (IL-6/IL-6R), insuline-transferrine-sélénium-éthanolamine, L-glutamine et pénicilline/Streptomycine/Amphotericin B. Tampon FACS : mélanger LE PBS avec 2 % de sérum de veau fœtal et 1 mM EDTA. Préparer le tampon de séparation magnétique (Voir tableau des matériaux). Préparer des médias à base de méthylcellulose (Voir tableau des matériaux). 2. Formation de colonie de LA CFP Cultivez les hSC à 70 – 80% d’afluence sur une plaque de 6 puits à 6 puits enduite de 0,5 g de cm-2 LM511-E8 dans mTeSR1 dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2. Dissociation de la CFP (Jour -4) Aspirer le milieu et laver les cellules avec DU PBS deux fois. Rincer les cellules avec une solution de dissociation. Incuber à 37 oC pendant 15 min (les cellules ne se desseriront pas pendant ce temps). Suspendre les cellules dans le milieu d’entretien PSC, transférer la suspension dans un tube de taille appropriée et centrifugeles les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant et suspendre les cellules dans le milieu de placage PSC. Plaquer la suspension PSC à une densité de 48 000 à 70 000 cellules cm-2 (selon la lignée cellulaire) sur un récipient en plastique microfabriqué et incuber toute la nuit dans l’incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2.NOTE: Nous recommandons 100 L puits-1 de suspension cellulaire dans un récipient en plastique micro-fabriqué de 96 puits. Vous ensemencez généralement 20 000 cellules bien-1 dans une assiette de 96 puits pour produire environ 100 sphéroïdes. Carrelage des sphéroïdes de la CFP sur LM511-E8 (Jour -3) Recueillir les sphéroïdes PSC dans un tube conique de 15 ml en pipetage doucement à l’aide de micropipetter P1000 et laisser les sphéroïdes se tenir debout à température ambiante pendant 2 min pour précipiter par gravité. Aspirer le supernatant. Suspendre dans le milieu de placage sphéroïde, distribuer la suspension dans une plaque de culture non enduite de 6 puits à une densité de 4-sphéroïdes cm-2 et la culture dans l’incubateur de 37 oC avec 5% de CO2 pendant trois jours. 3. Induction hémogénique (Jour 0) Aspirer le milieu, ajouter le milieu de différenciation Day0 et la culture dans l’incubateur de 37 oC avec 5 % D2 et 5 % de CO2 (incubateur hypoxique). Après deux jours de culture dans le milieu de différenciation Day0, aspirez le milieu, puis ajoutez le milieu de différenciation Day2 et la culture dans l’incubateur hypoxique. 4. Isolement de l’endothélium hémogénique (Jour 4) Deux jours plus tard, aspirez le milieu et lavez les cellules avec DU PBS deux fois. Rincer les cellules avec une solution de dissociation. Incuber dans l’incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 30 min. Suspendre délicatement les cellules dans 1 mM EDTA pour se dissocier au niveau unicellulaire, transférer la suspension dans un tube conique de 50 ml et centrifuge les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant et suspendre la pastille cellulaire avec 300 L de séparation magnétique tampon. Ajouter 100 l de CD34et de pipet s’il y a délicatement. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Jusqu’à 20 millions de cellules par 100 lC34 de ll peuvent être utilisées. Filtrer la suspension à l’intermédiaire d’une passoire à cellules de 40 m. Séparez les cellules CD34à l’aide d’un séparateur magnétique. 5. Induction de la transition endothéliale-hématopoétique (EHT) Enrobage de fibronectin Préparer le volume requis de 5 g/mL de fibrenectin-enduit solution en diluant 1 mg/mL de fibronectine dans PBS. Distribuer 0,5 ml de la solution de revêtement dans chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 min. Centrifugeles les cellules CD34 triées à 200 x g pendant 3 min. Resuspendre le granule cellulaire dans 1 mL de milieu EHT. Déterminer la densité cellulaire viable avec le compteur cellulaire. Ajuster la densité cellulaire à 200 000 cellules mL-1 en ajoutant le milieu EHT. Aspirez et jetez la solution de revêtement du puits enduit de fibronectin. Distribuer 0,5 mL de suspension cellulaire CD34dans chaque puits enduit de fibronectine. Incuber dans l’incubateur hypoxique pendant une semaine. 6. Analyse de cytométrie de flux des cellules hématopoïétiques Collection de cellules flottantes : Transférer le milieu de culture à un tube conique de 15 ml. Centrifugelement le milieu à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant. Collecte de cellules adhérentes Laver les cellules avec 0,5 mL de PBS deux fois. Rincer les cellules avec une solution dissociante et aspirer le liquide excédentaire. Incuber la plaque dans l’incubateur de 37 oC pendant 5 min. Resuspendre les cellules en 1 mL de tampon FACS. Mélanger les cellules flottantes et les cellules adhérentes. Centrifugeles les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant. Resuspendre dans 50 ‘L de tampon FACS. Incuber les cellules avec des anticorps anti-CD34 et anti-CD45 pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Laver les cellules avec PBS deux fois et centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant et resuspendre dans 0,5 mL de tampon FACS avec 0,5 g/mL 4’,6-diamidino-2-phenylindole. Mesurer l’expression CD34 et CD45 par cytomètre de flux. 7. Unité de formation de colonies (CFU) L’échec des cellules hématopoïétiques Collection de cellules hématopoïétiques : Transférer le milieu de la culture à un tube conique de 15 ml. Rincer délicatement le puits deux fois avec PBS. Centrifugeles les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant. Resuspendre en 1 mL de milieu EHT. Déterminer le numéro de cellule avec le compteur cellulaire. Ajoutez un volume de suspension équivalent de 10 000 cellules à 3 ml de support à base de méthylcellulose complété par des antibiotiques et mélangez bien 5 fois avec une seringue de 16 G ou 18 G. Distribuer toute la suspension des médias à base de méthylcellulose dans chaque puits d’une assiette de 6 puits. Incuber dans l’incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant deux semaines tout en restant humide. Ne pas déranger le plat. Les colonies sont sensibles au mouvement. Après deux semaines, compter les colonies au microscope.