Grabaciones electrofisiológicas de corrientes de iones de una sola célula bajo estrés de cizallamiento bien definido
Summary
El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada para su uso en la investigación de la activación en tiempo real de canales iónicos sensibles al mecano sensible por tensión de cizallamiento.
Abstract
Se sabe que la tensión de cizallamiento fluido desempeña un papel importante en la función endotelial. En la mayoría de los lechos vasculares, el estrés de cizallamiento elevado por aumentos agudos en el flujo sanguíneo desencadena una cascada de señalización que resulta en vasodilatación, aliviando así el estrés mecánico en la pared vascular. El patrón de estrés por cizallamiento también es bien conocido por ser un factor crítico en el desarrollo de la aterosclerosis con el estrés de cizallamiento laminar siendo ateroprotector y perturbado estrés de cizallamiento siendo pro-aterogénico. Si bien tenemos una comprensión detallada de las diversas vías de señalización de células intermedias, los receptores que primero traducen el estímulo mecánico en mediadores químicos no se entienden completamente. Los canales iónicos sensibles al mecano sensible son críticos para la respuesta a la cizalladura y regulan la señalización celular inducida por cizallamiento, controlando así la producción de mediadores vasoactivos. Estos canales se encuentran entre los primeros componentes de señalización activados para cortar y se han relacionado con vasodilatación inducida por cizallamiento mediante la promoción de la producción de óxido nítrico (por ejemplo, rectificación interna de K+ [Kir] y potencial de receptor transitorio [TRP] (p. ej., canales K+ [KCa] activados por Kir y calcio) y vasoconstricción inducida por cizallamiento a través de un mecanismo indeterminado que implica canales piezoeléctricos. Comprender el mecanismo biofísico por el cual estos canales son activados por fuerzas cortantes (es decir, directamente o a través de un receptor mecano primario) podría proporcionar posibles nuevos objetivos para resolver la fisiopatología asociada con la disfunción endotelial y la atrogénesis. Sigue siendo un desafío importante para registrar la activación inducida por el flujo de canales iónicos en tiempo real utilizando la electrofisiología. Los métodos estándar para exponer las células a tensión de cizallamiento bien definida, como el reómetro de cono y placa y la cámara de flujo de placa paralela cerrada no permiten el estudio en tiempo real de la activación del canal iónico. El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada que permite el registro electrofisiológico en tiempo real de canales iónicos sensibles a la tensión de cizallamiento bien definido.
Introduction
Las fuerzas hemodinámicas generadas por el flujo sanguíneo son bien conocidas por desempeñar un papel importante en la función endotelial y vascular1,2. También es bien sabido que varios tipos de canales iónicos responden agudamente a los cambios en la tensión de cizallamiento3,4,5 lo que lleva a la hipótesis de que los canales iónicos pueden ser sensores de tensión de cizallamiento primarios. Más recientemente, nosotros y otros mostramos que los canales iónicos mecanosensitive desempeñan un papel crítico en varias funciones vasculares sensibles al estrés de cizallamiento, incluyendo la respuesta vasoactiva a la tensión de cizallamiento6,7,8 , y la angiogénesis del desarrollo9. Los mecanismos de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos, sin embargo, son casi totalmente desconocidos. Es probable que esta brecha de conocimiento se deba a la dificultad técnica de realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión cortante bien definida. En este artículo, por lo tanto, proporcionamos un protocolo detallado paso a paso realizado rutinariamente en nuestro laboratorio para lograr este objetivo6,7,10,11.
El objetivo general de este método es permitir la investigación en tiempo real de la mecanoactivación del canal iónico bajo tensión de cizallamiento bien definida en el rango fisiológico. Esto se logra modificando una cámara de flujo de placa paralela estándar para permitir que una pipeta electrofisiológica se baje en la cámara y las células de acceso cultivadas en la placa inferior durante la exposición en tiempo real al flujo, proporcionando un enfoque único para lograr esto meta6,7,11. Por el contrario, las cámaras de flujo de placas paralelas estándar, descritas en publicaciones anteriores, se pueden utilizar para el análisis de imágenes en tiempo real de células expuestas a fuerzas de cizallamiento12 u otros enfoques no invasivos13,14, pero no para Electrofisiología. Del mismo modo, el aparato de cono y placa, otro enfoque poderoso para exponer las células a la tensión de cizallamiento15,16 tampoco es adecuado para grabaciones electrofisiológicas. Por lo tanto, estos dispositivos de flujo no permiten la investigación de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos. La dificultad para realizar grabaciones electrofisiológicas bajo flujo es la razón principal de la escasez de información sobre los mecanismos responsables de estos efectos cruciales.
En cuanto a los enfoques alternativos para lograr el mismo objetivo, no hay ninguno que sea tan preciso o controlado. Algunos estudios anteriores intentaron registrar la actividad del canal iónico bajo flujo exponiendo las células a una corriente de líquido procedente de otra pipeta traída a las proximidades de una célula desde más de17,18. Esto es altamente no fisiológico, ya que las fuerzas mecánicas generadas en estas condiciones tienen poco en común con los perfiles fisiológicos de tensión cortante en los vasos sanguíneos. Preocupaciones similares se aplican a los intentos de simular la tensión de cizallamiento fisiológica por perfusión de cámaras abiertas. Como se discutió en detalle en nuestro estudio anterior10, una interfaz de aire líquido abierto crea múltiples perturbaciones y recirculación, que no son fisiológicas. Para abordar todas estas preocupaciones, hemos diseñado una cámara de flujo de placa paralela modificada (MPP), también conocida como el “dispositivo de flujo mínimamente invasivo” en nuestros estudios anteriores6,7,10,11, hecho de acrílico y ampliamente utilizado en nuestro laboratorio. Sin embargo, a pesar de que la descripción original del diseño se ha publicado hace casi 20 años y es el único dispositivo de flujo que permite realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión de cizallamiento bien definida, esta metodología no ha sido adoptados por otros laboratorios y sólo hay muy pocos estudios que intenten registrar corrientes bajo flujo. Creemos, por lo tanto, que proporcionar una descripción detallada para el uso de la cámara de flujo MPP será de gran ayuda para las investigaciones que están interesadas en canales iónicos mecanosensitive y biología vascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema vascular está constantemente expuesto a fuerzas hemodinámicas activas, que activan los canales iónicos mecanosensibles3,22, pero las funciones fisiológicas de estos canales en la mecanotransducción inducida por el estrés de cizallamiento es sólo empezando a emerger4,6,8. Los mecanismos responsables de la mecanosensibilidad de los canales activados por t…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (R01 HL073965, IL) y (T32 HL007829-24, ISF). Los autores también quieren reconocer a la Tienda de Máquinas Científicas de la Universidad de Illinois en Chicago por generar nuestras últimas cámaras de flujo MPP.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
Referenzen
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