Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini
Summary
Le but de ce protocole est de décrire une chambre parallèle modifiée d’écoulement de plaque pour l’usage en étudiant l’activation en temps réel des canaux d’ion mechanosensitive par le stress de cisaillement.
Abstract
Le stress de cisaillement de fluide est bien connu pour jouer un rôle important dans la fonction endothéliale. Dans la plupart des lits vasculaires, le stress élevé de cisaillement des augmentations aigues du flux sanguin déclenche une cascade de signalisation ayant pour résultat la vasodilatation atténcitant ainsi le stress mécanique sur la paroi vasculaire. Le modèle de l’effort de cisaillement est également bien connu pour être un facteur critique dans le développement de l’athérosclérose avec l’effort laminaire de cisaillement étant atheroprotective et le stress perturbé de cisaillement étant pro-atherogenic. Bien que nous ayons une compréhension détaillée des différentes voies intermédiaires de signalisation cellulaire, les récepteurs qui traduisent d’abord le stimulus mécanique en médiateurs chimiques ne sont pas complètement compris. Les canaux ioniques mécanosensibles sont essentiels à la réponse au cisaillement et régulent la signalisation cellulaire induite par le cisaillement contrôlant ainsi la production de médiateurs vasoactifs. Ces canaux sont parmi les premiers composants de signalisation activés à cisaillement et ont été liés à la vasodilatation induite par le cisaillement par la promotion de la production d’oxyde nitrique (p. ex., rectification intérieure de Ket potentiel récepteur transitoire [TRP] canaux) et facteur d’hyperpolarisation de l’endothélium (p. ex., canaux K et K activés par le calcium) et vasoconstriction induite par le cisaillement par un mécanisme indéterminé qui implique des canaux piézoïdes. Comprendre le mécanisme biophysique par lequel ces canaux sont activés par des forces de cisaillement (c.-à-d. directement ou par un récepteur mécano-récepteur primaire) pourrait fournir de nouvelles cibles potentielles pour résoudre la pathophysiologie associée au dysfonctionnement endothélial et l’athérogenèse. Il est encore un défi majeur d’enregistrer l’activation induite par le flux des canaux ioniques en temps réel en utilisant l’électrophysiologie. Les méthodes standard pour exposer les cellules à un stress bien défini, comme le rhéomètre de cône et de plaque et la chambre d’écoulement parallèle fermée de plaque ne permettent pas l’étude en temps réel de l’activation de canal d’ion. Le but de ce protocole est de décrire une chambre de flux de plaque parallèle modifiée qui permet l’enregistrement électrophysiologique en temps réel des canaux ioniques mécanosensibles sous le stress bien défini de cisaillement.
Introduction
Les forces hémodynamiques générées par le flux sanguin sont bien connues pour jouer des rôles majeurs dans la fonction endothéliale et vasculaire1,2. Il est également bien connu que plusieurs types de canaux ioniques répondent vivement aux changements dans le stress de cisaillement3,4,5 conduisant à l’hypothèse que les canaux ioniques peuvent être des capteurs de stress de cisaillement primaire. Plus récemment, nous et d’autres avons montré que les canaux ioniques mécanosensibles jouent des rôles critiques dans plusieurs fonctions vasculaires sensibles au stress de cisaillement, y compris la réponse vasoactive au stress de cisaillement6,7,8 , et l’angiogenèse développementale9. Les mécanismes de la sensibilité de cisaillement-stress des canaux d’ion, cependant, sont presque totalement inconnus. Cette lacune de connaissances est probablement due à la difficulté technique d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini. Dans cet article, par conséquent, nous fournissons un protocole détaillé étape par étape régulièrement effectué dans notre laboratoire pour atteindre cet objectif6,7,10,11.
L’objectif global de cette méthode est de permettre l’investigation en temps réel de la mécanactivation du canal ionique sous un stress bien défini dans la gamme physiologique. Ceci est réalisé en modifiant une chambre parallèle standard d’écoulement de plaque pour permettre à une pipette électrophysiologique d’être abaissée dans la chambre et aux cellules d’accès cultivées sur la plaque inférieure pendant l’exposition en temps réel au flux, fournissant une approche unique pour réaliser ceci but6,7,11. En revanche, les chambres parallèles standard d’écoulement de plaque, décrites dans les publications précédentes peuvent être employées pour l’analyse en temps réel d’imagerie des cellules exposées aux forces de cisaillement12 ou à d’autres approches non-invasives13,14 mais pas pour Électrophysiologie. De même, l’appareil de cône et de plaque, une autre approche puissante pour exposer des cellules au stress de cisaillement15,16 n’est pas non plus approprié pour des enregistrements électrophysiologiques. Ainsi, ces dispositifs de débit ne permettent pas l’enquête sur la sensibilité au stress de cisaillement des canaux ioniques. La difficulté d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous le flux est la principale raison du manque d’informations sur les mécanismes responsables de ces effets cruciaux.
Pour ce qui est des approches alternatives pour atteindre le même objectif, il n’y en a aucune qui soit aussi précise ou contrôlée. Certaines études antérieures ont tenté d’enregistrer l’activité des canaux ioniques sous le flux en exposant les cellules à un flux de liquide provenant d’une autre pipette apportée à proximité d’une cellule de plus de17,18. C’est très non physiologique, car les forces mécaniques générées dans ces conditions ont peu en commun avec les profils physiologiques du stress de cisaillement dans les vaisseaux sanguins. Des préoccupations similaires s’appliquent aux tentatives de simuler le stress physiologique du cisaillement par perfusion de chambres ouvertes. Comme nous l’avons vu en détail dans notre étude précédente10, une interface à ciel liquide ouvert crée de multiples perturbations et recirculation, qui ne sont pas physiologiques. Pour répondre à toutes ces préoccupations, nous avons conçu une chambre de débit de plaque parallèle modifiée (MPP), également appelée « dispositif d’écoulement mini-invasif » dans nos études antérieures6,7,10,11, faite de l’acrylique et largement utilisé dans notre laboratoire. Cependant, en dépit du fait que la description originale de la conception a été publiée il y a près de 20 ans et qu’elle est le seul dispositif d’écoulement qui permet d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini, cette méthodologie n’a pas été adopté par d’autres laboratoires et il n’y a que très peu d’études qui tentent d’enregistrer les courants en cours d’écoulement. Nous croyons, par conséquent, que fournir une description détaillée de l’utilisation de la chambre de débit MPP sera d’une grande aide pour les chercheurs qui s’intéressent aux canaux ioniques mécanosensibles et la biologie vasculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système vasculaire est constamment exposé aux forces hémodynamiques actives, qui activent les canaux ioniques mécanosensibles3,22 mais les rôles physiologiques de ces canaux dans la mécanotransduction induite par le stress de cisaillement est seulement commence à émerger4,6,8. Les mécanismes responsables de la méchanosensibilité des canaux activés par le s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) et (T32 HL007829-24, ISF). Les auteurs aimeraient également remercier le Scientific Machine Shop de l’Université de l’Illinois à Chicago pour avoir généré nos dernières chambres de flux mPP.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
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