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Biochemie

Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

Nous cloner et analyser les gènes des reporters générant des ARN circulaires. Ces gènes reporter sont plus grands que les constructions pour analyser l’épissage linéaire et contenir des éléments Alu. Pour étudier les ARN circulaires, les constructions sont transfected dans les cellules et l’ARN résultant est analysé à l’aide de RT-PCR après l’élimination de l’ARN linéaire.

Abstract

En plus des ARM linéaires, de nombreux gènes eucaryotes génèrent des ARN circulaires. La plupart des ARN circulaires sont générés en rejoignant un site d’épissage 5′ avec un site d’épissage en amont 3′ dans un pré-mRNA, un processus appelé back-splicing. Cette circularisation est probablement facilitée par des structures secondaires dans le pré-mRNA qui amènent les sites d’épissage à proximité. Dans les gènes humains, les éléments Alu sont pensés pour promouvoir ces structures secondaires d’ARN, car les éléments d’Alu sont abondants et présentent des complémentarités de base les unes avec les autres lorsqu’ils sont présents dans des directions opposées dans l’ARN pré-m. Ici, nous décrivons la génération et l’analyse de grand élément Alu contenant des gènes de reporter qui forment des ARN circulaires. Grâce à l’optimisation des protocoles de clonage, des gènes reporter avec jusqu’à 20 kb de longueur d’insertion peuvent être générés. Leur analyse dans les expériences de co-transfection permet d’identifier les facteurs réglementaires. Ainsi, cette méthode peut identifier les séquences d’ARN et les composants cellulaires impliqués dans la formation circulaire d’ARN.

Introduction

Arn circulaires
Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN échoués isolés fermés covalentement qui sont exprimés dans la plupart des organismes. Ils sont générés en rejoignant un site d’épissage en aval 5′ à un site d’épissage en amont 3′, un processus appelé back-splicing (Figure 1A)1. Les séquences de l’ARNM pré-mRNA qui présentent une base complémentaire aussi courte que 30-40 nt apportent des sites d’attelle arrière dans un alignement approprié pour la formation d’ARN2. Chez l’homme, les éléments Alu 1, représentant environ 11% du génome3, forment de vastes structures d’ARN double brin dans l’ARN pré-mRNA en raison de leur auto-complémentarité4,5 et favorisent ainsi la formation de circRNAs1.

À l’heure actuelle, trois fonctions principales des circARN ont été décrites. Certains circRNAs lient microARN (miRNAs) et par la séquestration agissent comme des éponges miRNA6. Les CircRNAs ont été impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, par la concurrence avec l’épissage linéaire7 ou la modulation de l’activité du facteur de transcription8. Enfin, les circARN contiennent de courts cadres de lecture ouverts et des études de preuve de principe montrent qu’ils peuvent être traduits9,10. Cependant, la fonction de la plupart des circRNAs reste énigmatique. La majorité des ARN circulaires ont été détectés à l’aide de méthodes de séquençage de nouvelle génération11. Des analyses détaillées des gènes individuels à l’aide d’approches ciblées RT-PCR révèlent qu’un grand nombre d’ARN circulaires reste à découvrir12.

Utilisation de gènes reporter pour analyser le traitement pré-mRNA
L’analyse de l’ARNm dérivée des constructions de reporter d’ADN transfected dans des cellules est une méthode bien établie pour étudier l’épissage alternatif d’ARNm, qui peut être appliqué aux ARN circulaires. En général, l’exon alternatif, ses introns environnants, et les exons constitutifs sont amplifiés et clonés dans un vecteur d’expression eucaryote. Fréquemment, les introns sont raccourcis. Les constructions sont transfected dans des cellules eucaryotes et généralement analysés par RT-PCR13,14. Cette approche a été largement utilisée pour cartographier les sites d’épissage réglementaire et les facteurs trans-acteurs dans les expériences de co-transfection13,15,16,17,18. En outre, la génération de minigènes exprimant des protéines a permis le dépistage des substances qui changent l’épissage alternatif19,20.

La méthode a été appliquée aux ARN circulaires. À l’heure actuelle, au moins 12 épines dorsales minigène ont été décrites dans la littérature et sont résumées dans le tableau 1. À l’exception du système d’expression basé sur l’ARN TRNA21,22, ils sont tous dépendants des promoteurs de polymérase II. Ici, nous décrivons une méthode pour générer des minigènes de reporter humain pour déterminer les cis et les facteurs trans-agissant impliqués dans la génération des ARN circulaires. Un aperçu de la méthode à l’aide de séquences d’un gène reporter publié23 est montré dans la figure 1.

Protocol

1. Conception des constructions Utilisez le navigateur24 du génome de l’UCSC pour identifier les éléments répétitifs nécessaires à la formation circulaire d’ARN et les incorporer dans les constructions. Fait important, les amorces pour l’amplification doivent être en dehors des éléments répétitifs. Coller la séquence circulaire d’ARN(figure supplémentaire 1 est une séquence d’essai) en <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?com…

Representative Results

Les gènes de reporter permettent la détermination des facteurs réglementaires qui influencent la formation circulaire d’ARN. Cependant, ces gènes de reporter sont grands et contiennent des éléments répétitifs qui rendent souvent les constructions d’ADN instables. En raison de leur grande taille, il est souvent nécessaire de supprimer des parties des introns, qui est atteint en amplifiant les pièces génomiques contenant les exons et les parties introniques flanquantes plus petites. Ces morceaux d’ADN sont…

Discussion

En général, les ARN circulaires sont faibles abondants1, ce qui complique l’étude de leur fonction et de leur formation. Semblable aux ARN linéaires13, l’utilisation de minigènes reporter permet l’identification des cis et des facteurs trans-acteurs qui régulent la formation d’ARN circulaires. Ainsi, cette approche génère des hypothèses qui peuvent être testées plus en utilisant les gènes endogènes.

L’étape la plus critiqu…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense DoD subvention AZ180075. Stefan Stamm remercie Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin a été soutenue par le DAAD, programme allemand d’échange académique, Justin R. Welden a été récipiendaire de l’Université du Kentucky Max Steckler Award.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
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Referenzen

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Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
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