In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için
Summary
Drosophila melanogaster‘da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ve ilerlemesi hakkında anlaşılması gereken çok şey vardır, temel alınan genler de dahil olmak üzere sorumlu. Kimyasal mutajenler kullanarak ileri genetik tarama Drosophila ve insanlarla uyumlu hücresel yollar paylaşan diğer model organizmalar arasında genler için mutant fenotipleri haritalama için yararlı bir stratejidir. Eğer ilgi mutasyona uğramış gen sineklerin erken gelişimsel aşamalarında ölümcül değilse, bir tırmanma tahlil düşük tırmanma oranları gibi, azalmış beyin işleyişi fenotipik göstergeleri için ekrana yapılabilir. Daha sonra, beyin dokusunun ikincil histolojik analizi, nörodejenerasyon phenoypes skorlayarak genin nörokoruyucu fonksiyonunu doğrulamak için gerçekleştirilebilir. Gen haritalama stratejileri, bu aynı testlere dayanan meiyotik ve eksiklik eşlemesinin, faiz geninde olası nükritit değişikliklerini belirlemek için DNA sıralamasına göre izlenmesini içerir.
Introduction
Nöronlar en çok post-mitotik ve bölünmüş1,2aciz içindir. Çoğu hayvanlarda, nörokoruyucu mekanizmalar bu hücrelerin organizmanın ömrü boyunca korunması için var, özellikle de nöronların hasarlara karşı en savunmasız olduğu yaşlarındadır. Bu mekanizmaların temelindeki genler, nörodejenerasyon gösteren mutantlar, nörokoruma kaybı için fenotipi bir gösterge, ileri genetik protokol kullanılarak tespit edilebilir. İleri genetik ekranlar etil methanesulfonate (EMS) veya n-etil-N-nitrosourea (ENU) gibi kimyasal mutajenler kullanarak, özellikle onlar neden rastgele nokta mutasyonlar nedeniyle yararlıdır, ışık döken bir doğal tarafsız yaklaşım sonuçlanan Ökaryotik model organizmalarda sayısız gen fonksiyonları3,4,5 (aksine, X-Ray Mutagenezi DNA molası yaratır ve can noktası mutasyonları yerine yeniden düzenlemeye neden olabilir6).
Ortak meyve sinek Drosophila melanogaster bu ekranlar için ideal bir konu yüksek kalite, iyi detaylandırılmış genom dizisi nedeniyle, son derece gelişmiş genetik araçları ile bir model organizma olarak uzun geçmişi, ve en önemlisi, onun paylaşılan insanlarla evrimsel Tarih7,8. Bu protokolün uygulanabilirliğini kısıtlayan bir faktör, mutasyona uğramış genlerin neden olduğu erken sakatlık olup,9yaşına kadar test edilmesini önleyecek. Ancak, ölümcül olmayan mutasyonlar için, negatif geoteksen yararlanır bir tırmanma tahlil, basit, ancak kapsamlı, ölçüm özürlü motor işlevi10fonksiyon. Yeterli lokomotor reaktivite sergilemek için, sinekler yönü belirlemek için nöral işlevlere bağlıdır, konumunu duygusu, ve hareketi koordine. Uyaranlara yanıt olarak yeterince tırmanmaya uçar yetersizlik bu nedenle nörolojik kusurları gösterebilir11. Belirli bir arızalı tırmanış fenotipi belirlendikten sonra, beyin dokusunun histolojik analizi gibi ikincil bir ekran kullanarak daha fazla test, tırmanma kusurlu sineklerin nörodejenerasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sonraki Gen haritalaması daha sonra, kusurlu nörokoruyucu geni taşıyan kromozom üzerindeki genomik bölgeyi ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Kromozomal bölgeyi daraltmak için, kromozom üzerinde bilinen konumlar ile baskın Marker genler taşıyan mutant sinek hatları kullanarak Mayoz bölünmenin haritalama yapılabilir. Marker genler, iki loci arasındaki yeniden kombinasyon sıklığı olarak mutasyon için bir referans noktası olarak hizmet bir geni yaklaşık konumunu eşlemek için kullanılabilecek bir ölçülebilir mesafe sağlar. Son olarak, mutasyon eşleştirilen kromozomal bölgede dengeli eksiklikleri taşıyan satırlarla mutant hatlarının kesişmesi, bilinen fenotipi5‘ i ifade ederse, faiz geni doğrulanabilir bir uluslara testi oluşturur. Tanımlanan gen, muhtemelen değiştirilmiş bir amino asit dizileri ile sonuçlanan polimorfik nüklotit dizileri, geni sıralayarak ve Drosophila genom dizisiyle karşılaştırarak değerlendirilebilir. İlgi geni sonraki karakterizasyonu ek mutant alleles test içerebilir, mutasyon kurtarma deneyleri ve ek fenotiplerin incelenmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila ileri genetik ekranlar, Yaş bağımlı nörokoruma dahil olmak üzere farklı biyolojik süreçlerde yer genler belirlemek için etkili bir yaklaşım olmuştur5,23,24, 25. bu stratejiyi kullanarak, brat ‘ı yeni bir nörokoruyucu gen17olarak tanımlamada başarılı olduk.
Bu protokoldeki önemli bir adım, Histo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Özellikle Dr. Barry Ganetzky ‘ye, genetik ekranın hangi laboratuarında gerçekleştirildiği, velet ‘in nörokoruyucu bir gen olarak tanımlanması ve karakterizasyonu için minnettarız. Biz nazik ENU-mutagenized Bu yazıda sunulan genetik ekranda kullanılan uçar koleksiyonu sağlayan Dr Steven Robinow teşekkür ederiz. Ganetzky laboratuarı üyelerine, DRS. Grace Boekhoff-Falk ve David wassarman ‘ın bu projenin süresi boyunca yararlı tartışmalar için teşekkür ediyoruz, Ling Ling Ho ve Bob KREBER teknik yardım için, Dr. aki Ikeda onun Mikrotom tesis kullanımı için Wisconsin Üniversitesi ve Dr. kim Lackey ve Alabama Üniversitesi ‘nde optik analiz tesisi.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
Referenzen
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetik. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetik. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetik. 161 (3), 1197-1208 (2002).
