In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo

Les neurones sont pour la plupart post-mitotiques et incapables de diviser^1,2. Chez la plupart des animaux, des mécanismes neuroprotecteurs existent pour maintenir ces cellules tout au long de la vie de l’organisme, en particulier à la vieillesse lorsque les neurones sont les plus vulnérables aux dommages. Les gènes sous-jacents à ces mécanismes peuvent être identifiés chez les mutants présentant une neurodégénérescence, un indicateur phénotypique de la perte de neuroprotection, à l’aide d’un protocole génétique avancé. Les écrans génétiques avancés utilisant des mutagènes chimiques tels que le méthane sulfonate éthylique (EMS) ou le N-éthyl-N-nitrosourea (ENU) sont particulièrement utiles en raison des mutations ponctuelles aléatoires qu’ils induisent, résultant en une approche intrinsèquement impartiale qui a mis en lumière de nombreuses fonctions génétiques dans les organismes modèles eucaryotes^3,4,5 (en revanche, la mutagénèse des rayons X crée des ruptures d’ADN et peut entraîner un réarrangement plutôt que des mutations ponctuelles⁶).

La mouche commune des fruits Drosophila melanogaster est un sujet idéal pour ces écrans en raison de sa haute qualité, séquence du génome bien annoté, sa longue histoire en tant qu’organisme modèle avec des outils génétiques très développés, et surtout, son partagé histoire évolutive avec les humains^7,8. Un facteur limitant dans l’applicabilité de ce protocole est la létalité précoce causée par les gènes mutés, ce qui empêcherait les tests à l’âge de⁹ans . Cependant, pour les mutations non létales, un test d’escalade, qui tire parti de la géotaxie négative, est une méthode simple, bien que vaste, de quantifier le fonctionnement moteur altéré¹⁰. Pour montrer une réactivité locomotrice suffisante, les mouches dépendent des fonctions neuronales pour déterminer la direction, sentir sa position et coordonner le mouvement. L’incapacité des mouches à grimper suffisamment en réponse à des stimuli peut donc indiquer des anomalies neurologiques¹¹. Une fois qu’un phénotype d’escalade défectueux particulier est identifié, d’autres essais utilisant un écran secondaire tel que l’analyse histologique du tissu cérébral, peuvent être employés pour identifier la neurodégénérescence dans les mouches grimpantes-défectueuses. La cartographie génétique ultérieure peut ensuite être utilisée pour révéler la région génomique sur le chromosome porteur du gène neuroprotecteur défectueux d’intérêt. Pour réduire la région chromosomique d’intérêt, la cartographie méiotique utilisant des lignées de mouches mutantes portant des gènes marqueurs dominants avec des emplacements connus sur le chromosome peut être effectuée. Les gènes marqueurs servent de point de référence pour la mutation car la fréquence de la recombinaison entre deux loci fournit une distance mesurable qui peut être utilisée pour cartographier l’emplacement approximatif d’un gène. Enfin, le franchissement des lignes mutantes avec des lignes portant des déficiences équilibrées sur la région chromosomique méiotatiquement cartographiée d’intérêt crée un test de complémentaration dans lequel le gène d’intérêt peut être vérifié si son phénotype connu est exprimé⁵. Les séquences de nucléotides polymorphes dans le gène identifié, ce qui pourrait entraîner une modification des séquences d’acides aminés, peuvent être évaluées en séquençant le gène et en le comparant à la séquence du génome de Drosophila. La caractérisation ultérieure du gène d’intérêt peut inclure l’essai d’allèles mutants supplémentaires, des expériences de sauvetage de mutation et l’examen de phénotypes additionnels.