En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

Las neuronas son en su mayor parte post-mitotica sin dividir^1,2. En la mayoría de los animales, existen mecanismos neuroprotectores para mantener estas células a lo largo de la vida útil del organismo, especialmente a la edad anterior cuando las neuronas son más vulnerables al daño. Los genes subyacentes a estos mecanismos se pueden identificar en mutantes que presentan neurodegeneración, un indicador fenotípico para la pérdida de neuroprotección, utilizando un protocolo genético directo. Las pantallas genéticas delanteras que utilizan mutágenos químicos como el metanoesulfonato etílico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU) son particularmente útiles debido a las mutaciones de puntos aleatorios que inducen, lo que resulta en un enfoque inherentemente imparcial que ha arrojado luz sobre numerosas funciones genéticas en los organismos modelo eucariotas^3,4,5 (en contraste, la mutagénesis de rayos X crea roturas de ADN y puede dar lugar a reorganización en lugar de mutaciones puntuales^6).

La mosca fruta común Drosophila melanogaster es un tema ideal para estas pantallas debido a su alta calidad, secuencia de genoma bien anotada, su larga historia como organismo modelo con herramientas genéticas altamente desarrolladas, y lo más significativo, su compartido historia evolutiva con los seres humanos^7,8. Un factor limitante en la aplicabilidad de este protocolo es la letalidad temprana causada por los genes mutados, lo que impediría las pruebas a la edad de⁹años. Sin embargo, para las mutaciones no letales, un ensayo de escalada, que aprovecha la geotaxis negativa, es un método simple, aunque extenso, para cuantificar el funcionamiento motor deteriorado¹⁰. Para exhibir suficiente reactividad locomotora, las moscas dependen de las funciones neuronales para determinar la dirección, detectar su posición y coordinar el movimiento. Por lo tanto, la incapacidad de las moscas para subir lo suficiente en respuesta a los estímulos puede indicar defectos neurológicos¹¹. Una vez que se identifica un fenotipo de escalada defectuoso en particular, se pueden utilizar más pruebas utilizando una pantalla secundaria como el análisis histológico del tejido cerebral para identificar la neurodegeneración en moscas que escalan. La cartografía genética posterior se puede utilizar para revelar la región genómica en el cromosoma que lleva el gen neuroprotector defectuoso de interés. Para reducir la región cromosómica de interés, se puede realizar un mapeo meiotico utilizando líneas volantes mutantes que transportan genes marcadores dominantes con ubicaciones conocidas en el cromosoma. Los genes marcadores sirven como punto de referencia para la mutación, ya que la frecuencia de recombinación entre dos loci proporciona una distancia medible que se puede utilizar para mapear la ubicación aproximada de un gen. Por último, el cruce de las líneas mutantes con líneas que llevan deficiencias equilibradas en la región cromosómica meiotamente mapeada de interés crea una prueba de complementación en la que se puede verificar el gen de interés si se expresa su fenotipo conocido⁵. Las secuencias de nucleótidos polimórficos en el gen identificado, lo que puede resultar en secuencias de aminoácidos alteradas, se pueden evaluar secuenciando el gen y comparándolo con la secuencia del genoma de Drosophila. La caracterización posterior del gen de interés puede incluir pruebas de alelos mutantes adicionales, experimentos de rescate de mutaciones y examen de fenotipos adicionales.