Summary

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

Abstract

Er is veel te begrijpen over het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de onderliggende genen die verantwoordelijk zijn. De voorwaartse genetische screening met behulp van chemische mutagene agentia is een nuttige strategie voor het in kaart brengen van Mutante fenotypes op genen bij Drosophila en andere model organismen die geagglomerde cellulaire trajecten met mensen delen. Als het gemuleerde gen van belang niet dodelijk is in vroege ontwikkelingsstadia van vliegen, kan een klim test worden uitgevoerd om te schermen voor fenotypische indicatoren van verminderde hersen werking, zoals lage klim snelheden. Vervolgens kan secundaire histologische analyse van hersenweefsel worden uitgevoerd om de neuroprotectieve functie van het gen te controleren door het scoren van neurodegeneratie fenotypes. Genmapping strategieën omvatten Meiotische en deficiëntie mapping die afhankelijk zijn van deze zelfde testen kunnen worden gevolgd door DNA-sequencing om mogelijke nucleotide veranderingen in het gen van belang te identificeren.

Introduction

Neuronen zijn voor het grootste deel post-mitotische en niet in staat om1,2te verdelen. Bij de meeste dieren bestaan neuroprotectieve mechanismen om deze cellen gedurende de levensduur van het organisme te behouden, vooral op oudere leeftijd wanneer neuronen het meest kwetsbaar zijn voor beschadiging. Genen die aan deze mechanismen ten grondslag liggen, kunnen worden geïdentificeerd bij mutanten die neurodegeneratie vertonen, een fenotypische indicator voor het verlies van neuroprotectie, met behulp van een forward genetisch protocol. Voorwaartse genetische schermen die gebruik maken van chemische mutagene agentia, zoals ethyl methanesulfonaat (EMS) of N-ethyl-N-nitrosoureumderivaat (ENU), zijn met name nuttig vanwege de willekeurige puntmutaties die zij induceren, resulterend in een inherent onbevooroordeelde benadering die licht heeft werpen op talrijke genfuncties in eukaryotische model organismen3,4,5 (in tegenstelling, Röntgen mutagenese creëert DNA-onderbrekingen en kan resulteren in herschikking in plaats van puntmutaties6).

De gewone fruitvlieg Drosophila melanogaster is een ideaal onderwerp voor deze schermen vanwege de hoge kwaliteit, goed geannoleerde genoom sequentie, zijn lange geschiedenis als modelorganisme met sterk ontwikkelde genetische hulpmiddelen, en het meest aanzienlijk, zijn gedeelde evolutionaire geschiedenis met mensen7,8. Een beperkende factor in de toepasselijkheid van dit protocol is vroege letaliteit veroorzaakt door de gemuleerde genen, die zou voorkomen dat testen op oudere leeftijd9. Voor niet-dodelijke mutaties is een klim test, die gebruik maakt van negatieve geotaxi’s, echter een eenvoudige, maar uitgebreide methode om verminderde motorische werking10te kwantificeren. Om voldoende motorische reactiviteit te vertonen, zijn vliegen afhankelijk van neurale functies om de richting te bepalen, de positie ervan te voelen en de beweging te coördineren. Het onvermogen van vliegen om voldoende te klimmen in reactie op prikkels kan daarom duiden op neurologische gebreken11. Zodra een bepaalde defecte klim fenotype is geïdentificeerd, kan verder testen met behulp van een secundair scherm zoals histologische analyse van hersenweefsel worden gebruikt om neurodegeneratie in klimmen-defecte vliegen te identificeren. Daaropvolgende genmapping kan vervolgens worden gebruikt om de genomische regio te onthullen op het chromosoom dat het defecte neuroprotectieve gen van belang draagt. Om de chromosomale regio van belang te verfijnen, kan Meiotische mapping met behulp van Mutante vlieg lijnen met dominante marker genen met bekende locaties op het chromosoom worden uitgevoerd. De marker genen dienen als referentiepunt voor de mutatie, aangezien de frequentie van recombinatie tussen twee loci een meetbare afstand biedt die kan worden gebruikt om de geschatte locatie van een gen in kaart te kunnen gebracht. Ten slotte creëert het kruisen van de gemuteerde lijnen met lijnen die evenwichtige tekortkomingen vertonen op de in de meiotisch toegewezen chromosomale regio van belang een complementatie test waarbij het gen van belang kan worden geverifieerd als het bekende fenotype5wordt uitgedrukt. Polymorfe nucleotide sequenties in het geïdentificeerde gen, mogelijk resulterend in een veranderde aminozuur sequenties, kunnen worden geëvalueerd door het gen te sequentiëren en te vergelijken met de Drosophila genoom sequentie. Latere karakterisering van het gen van belang kan zijn het testen van extra Mutant allelen, mutatie redding experimenten en onderzoek van aanvullende fenotypes.

Protocol

1. voorbereiding en veroudering van vliegen Verkrijg of Genereer6 een verzameling Drosophila mutanten die zullen worden gebruikt voor het genetische scherm. Hier worden ENU-mutageen lijnen toegewezen aan het tweede chromosoom en evenwichtig over Cyo gebruikt. Versterk de experimentele genotype-lijnen in een incubator ingesteld bij 25 °C, 12 uur licht/donker cyclus op maïsmeel-melasse medium. Verzamel ongeveer 20 homozygoot nakomelingen tussen 0-2 d…

Representative Results

In deze aerticula presenteren we de stappen die worden gebruikt om de genen hersentumor (Brat) te identificeren als een rol spelen bij het onderhoud van neuronale integriteit (bijv. neuroprotectie) bij volwassen vliegen17; een methodologie die kan worden gebruikt om genen te identificeren die betrokken zijn bij neuroprotectie. We gebruikten een voorwaartse genetische benadering (de strategie wordt geschetst in Figuur 1a</stron…

Discussion

Voorwaartse genetische schermen in Drosophila zijn een effectieve benadering geweest om genen te identificeren die betrokken zijn bij verschillende biologische processen, waaronder leeftijdsafhankelijke neuro bescherming5,23,24, 25. met behulp van deze strategie, we waren succesvol in het identificeren van Brat als een nieuwe neuroprotectieve gen17.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn vooral dankbaar voor Dr. Barry Ganetzky, in Who ‘s Lab het genetische scherm werd uitgevoerd, waardoor de identificatie en karakterisering van Brat als een neuroprotectieve gen. We danken Dr. Steven Robinow voor het vriendelijk verstrekken van de verzameling van ENU-gemutageniseerde vliegen gebruikt in het genetische scherm gepresenteerd in dit artikel. Wij danken de leden van Ganetzky Lab, drs. Grace Boekhoff-Falk en David Wassarman voor nuttige besprekingen gedurende de gehele duur van dit project, Ling Ling Ho en Bob Kreber voor technische assistentie, Dr. Aki Ikeda voor het gebruik van zijn microtoom faciliteit aan de University of Wisconsin en Dr. Kim Lackey en de optische analyse faciliteit aan de Universiteit van Alabama.

Materials

Major equipment
Fume hood for histology
Light Microscope Nikon Eclipe E100 Preferred objective for imaging is X20
Imaging software Nikon
Microscope Camera Nikon
Thermal cycler Eppendorf
Fly pushing and climbing assay
VWR® Drosophila Vial, Narrow VWR 75813-160
VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-912
Standard mouse pad
Stereoscope Motic Model SMZ-168
CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) Genesee Scientific 54-104, 59-121, 59-172 Doesn’t iinclude CO2 tank
Fine-Tip Brushes SOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila Incubator VWR 89510-750
Gene mapping
CantonS Bloomington Drosophila Stock Center 9517
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 5905
yw  Bloomington Drosophila Stock Center 6599
Drosophila line used for recombination mapping Bloomington Drosophila Stock Center 3227 Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco]  Bloomington Drosophila Stock Center 2555 Drosophila balancer line used for recombination mapping
Deficiency Kit for chromosome 2L Bloomington Drosophila Stock Center DK2L Cook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%) Thermo Fischer Scientific A4094
Chloroform Thermo Fischer Scientific C298-500
Glacial Acetic Acid Thermo Fischer Scientific A38-500
Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Thermo Fischer Scientific 05-408-129
Histochoice clearing agent 1X VWR Life Sciences 97060-934
Harris Hematoxylin VWR 95057-858
Eosin VWR 95057-848
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium Thermo Scientific™ 4112 22-110-610 CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus Azer Scientific
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545M Dimensions: 24×60 mm
Traceable timer VWR
Slide Warmer Barnstead International model no. 26025
Slide tray and racks DWK Life Sciences Rack to hold 20 slides
Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps Fisherbrand 10-316A
Kimwipes™ Kimberly-Clark™ Professional 
6 inch Puritan applicators Hardwood Products Company, Guilford, Maine 807-12
VWR® Razor Blades VWR 55411-050
Tupperware or glass containers for histology liquids 16 + 1 for running water
High Profile Coated Microtome Blades VWR 95057-834
Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L Corning™
Beaker Or other container for ice water and cassettes
Tissue Bath Precision Scientific Company 66630
Microtome Leica Biosystems
Molecular analysis
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Ex Taq DNA polymerase TaKaRa 5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain   Invitrogen™
UltraPure™ Agarose  Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder  Invitrogen™
ApE-A plasmid Editor software Available for free download
Statistical analysis
R software package
Further analysis
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center 59967

Referenzen

  1. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  2. Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
  3. Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
  4. Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  7. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  8. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  10. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  11. Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
  12. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  13. R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  14. Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
  15. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
  16. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
  17. Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
  18. Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetik. 135 (1), 81-95 (1993).
  19. Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
  20. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
  21. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetik. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  24. Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
  25. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  26. Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
  27. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  28. Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
  29. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetik. 161 (3), 1197-1208 (2002).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Gevedon, O., Bolus, H., Lye, S. H., Schmitz, K., Fuentes-González, J., Hatchell, K., Bley, L., Pienaar, J., Loewen, C., Chtarbanova, S. In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59720, doi:10.3791/59720 (2019).

View Video