결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용
Summary
갤러리아 멜로넬라는 최근 결핵 균복합체에 대한 재현가능하고 저렴하며 윤리적으로 허용되는 감염 모델로 설립되었습니다. 여기에서 우리는 생물 발광 균 bovis BCG 럭스와 G. 멜로넬라의 성공적인 감염을 확립하기 위해 취한 단계를 설명하고 보여줍니다.
Abstract
결핵은 전염병 사망률의 주요 한 글로벌 원인이고 세계 인구의 대략 사분의 일은 결핵균에 감염되는 것으로 여겨진다. 수십 년간의 연구에도 불구하고 병원성 유기체로서 M. 결핵의 성공 뒤에 있는 많은 메커니즘이 조사되어야 하며, 보다 안전하고 효과적인 항균 제의 개발이 시급히 증가하고 약물 내성 결핵의 확산. 그러나, 결핵 연구의 진행은 비싸고, 시간이 걸리고, 윤리적으로 도전적인 전통적인 포유류 감염 모형에 의해 병목 현상됩니다. 이전에 우리는 M. 결핵 복합체의 구성원을 위한 소설, 재현가능, 저비용, 높은 처리량 및 윤리적으로 허용되는 감염 모형으로 곤충 갤러리아 mellonella (큰 왁스 나방)의 애벌레를 설치했습니다. 여기에서 우리는 생물 발광 성 진균 bovis BCG 럭스와 G. 멜로넬라의 유지 보수, 준비 및 감염을 설명합니다. 이 감염 모델을 사용하여, 진균 투여 량 의존적 독성을 관찰 할 수 있으며, 생물 발광 측정을 사용하여 생체 내 진균 부담의 신속한 판독은 쉽게 달성하고 재현 할 수 있습니다. 전사분석을 위한 완전 하게 비고를 받은 게놈의 부족과 같은 한계가 존재하지만, 유전적으로 유사한 곤충에 대한 존재론적 분석이 수행될 수 있다. 결핵에 대한 저비용, 신속하고 윤리적으로 수용 가능한 모델로서, G. mellonella는 약물 효능 및 독성을 결정하고, 기존의 포유류를 사용하기 전에 비교 균균 독성을 결정하기 위한 사전 스크린으로 사용될 수 있습니다. 모델. G.mellonella-mycobacteria 모델의 사용은 현재 결핵 연구에 사용되는 동물의 상당수의 감소로 이어질 것입니다.
Introduction
결핵 (TB)는 연간 9백만 건의 새로운 사례와 150만 명의 사망자1을가진 글로벌 공중 위생에 중요한 위협입니다. 또한, 세계 인구의 1/4이 질병의 원인인 결핵(Mtb)에 감염된 것으로 추정된다. 감염된 인구 중 5-10%는 일생 동안 활성 결핵 질환을 앓게 됩니다. 더욱이, 다중 약 저항하는 (MDR) 및 광용약 (XDR) 저항하는 Mtb의 출현 그리고 퍼짐은 질병 통제에심각한 위협을 제기합니다, 와 123 국가는 적어도 1개의 XDR 케이스 1를 보고했습니다. 결핵의 치료는 적어도 4 개의 항 균제 의 칵테일을 필요로하며, 그 중 는 리팜피신이 최소 6 개월 동안 처방됩니다. 치료는 종종 복잡 한 부작용 및 독성과 관련 된. 결핵에 대하여 유일한 허가된 백신에서 보호, 진균 bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), 가변 2입니다. 결핵의 병인에 대한 불완전한 이해는 새로운 치료 및 예방 접종 전략의 개발을 크게 방해합니다.
수십 년 동안 동물 감염 모델은 결핵 연구가 감염에 대한 기본 병인 및 숙주 반응을 이해하고 새로운 항균제, 면역 치료제 및 새로운 백신 후보물질을 평가하는 데 필수적이었습니다3, 4. 그러나 결핵의 동물 감염 모델을 사용한 연구는 결핵 감염의 발병 기전과 진행이 복잡하기 때문에 악명이 높고 질병의 전체 스펙트럼과 중요한 특징을 모방하는 단일 동물 모델이 없습니다5 ,6. 또한, 동물 실험은 비용이 많이 들고, 수행해야 하는 시간이 많이 걸리며 완전한 윤리적 정당성이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 결핵의 동물 감염 모델은 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이), 기니피그, 토끼, 소, 돼지, 마우스 및 제브라피시각각그들의 한계를 갖는3,4. murine 모형은 비용, 근친 선의 가용성, 감염의 재현성 및 면역학 시약의 풍부 때문에 가장 일반적으로 이용되는 모형입니다. 그러나, 그(것)들은 전형적으로 잠복 결핵 감염 (LTBI)6의특징인 저산소증의 지역과 관련되었던 육아종을 형성하지 않습니다. 기니 피그는 Mtb 감염에 매우 취약, 병리와 인간에서 그와 유사한 초기 육아종 형성, 백신 테스트에 널리 사용 된다; 그러나 면역 학적 시약의 부족은 감염 모델7로사용을 방해합니다. Zebrafish는 작은 크기, 빠른 번식 및 고급 유전 도구로 인해 초기 단계 의 전임상 연구에서 대규모 스크리닝에 적합하지만 해부학적 및 생리학적으로 인간과 다르며 인간에게만 취약합니다. 마이코박테리움 마리눔 감염3. 인간 Mtb 감염과 가장 밀접하게 유사한 동물 모델은 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이)이지만, 그들은 비싸고 그들의 사용을 상당히 제한하는 상당한 윤리적 및 실용적인 고려사항을 가지고있다8.
큰 왁스 나방이나 벌집 나방의 곤충 유충,갤러리아 멜로넬라, 다양한 세균 및 곰팡이 병원균에 대한 감염모델로 서 점점 더 인기를 끌고 있다 9, 그리고 새로운 항균 약물 후보에 대한 화면으로 10. G. mellonella는 척추 동물11과 높은 수준의 구조적 및 기능적 유사성을 공유하는 정교한 선천적 면역 체계 (세포 및 체액 방어로 구성)로 인해 성공적인 무척추 동물 모델입니다. . 이는 혈세포(포유류 대식세포 및 호중구와 기능적으로 유사함)에 의한 병원균의 식균과 같은 면역 기전을 포함하며,12,13,항균 펩티드(AMPs)의 생산 및 순환 및 G. 멜로넬라11의혈림프 (포유류 혈액과 유사) 내의 보체와 유사한 단백질. 다른장점 9,14,15 모델로 G. mellonella 애벌레포함 1) 그들의 큰 크기 (20−30 mm) 쉬운 조작 및 감염에 대 한 허용, 조직의 컬렉션 뿐만 아니라 분석을 위한 헤모림프, 2) 37°C에서의 간편한 유지보수, 인간 병원체 연구를 위한 용이함, 3) 마취없이 주사에 의한 정밀감염, 4) 항균제의 효능평가, 5) 부족 포유류의 사용에 비해 윤리적 제약, 6) 큰 그룹 크기는 더 큰 재현성을 허용하는 동물 모델에 비해 사용될 수 있으며, 7) 감염 실험에 대한 짧은 시간이 필요합니다.
최근 연구에서, 우리는 G. mellonella가 생물 발광 M. bovis BCG lux에 의한 감염의 병인을 연구하기위한 새로운 감염 모델로 사용될 수 있음을 입증, 백신 균주 및 회원의 유전자 변형 버전 Mtb 단지 (MTBC)16. G. mellonella는 이전에 비 결핵 진균 (NTM)에 대한 감염 모델로 사용되었지만, 주로 M. 마리눔 및 진균 농양17,18,MTBC를 이용한 연구는 리 외16. Mtb의 대리로 봉쇄 수준 (CL) 2에서 사용할 수있는 생물 발광 비 병원성 진균 균주는 병원성 진균에 비해 안전성과 실용성의 장점을 제공합니다. BCG 럭스에감염 에 이어, 애벌레는 결핵 감염의 설립에 선천적 면역의 역할에 귀중한 통찰력을 제공 할 수있는 초기 육아종과 같은 구조를 개발하기 시작16. 또한, 이러한 간단한 무척추동물 감염 모델은 재현성을 위해 조절된 도전과 다중 복제를 통합한 결핵 발병기전에 대한 신속하고 저렴한 비용의 신뢰할 수 있는 평가를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 더욱이, 이 모델은 초기 개발에서 신규한 항결핵 약물 및 백신 후보를 스크리핑하는데 사용될 가능성이 있으며, 실험에서 동물의 전체 수를 감소시킵니다. 숙주 및 병원체 구조의 변화를 측정하는 능력, 전사체 및 프로테오메는 약물 표적을 결정하고 새로운 약물 및 치료 백신의 작용 메커니즘을 평가하는 능력도 유리하다.
여기에서 우리는 생물 발광 M. bovis BCG 럭스 접종및 진균 감염을 위한 G. mellonella 애벌레의 제조를 위한 실험 적인 프로토콜을 기술합니다, 뿐만 아니라 애벌레와 진균균 둘 다의 결정 감염에 응하여 생존.
Protocol
Representative Results
Discussion
감염 모델로 G. mellonella의 사용은 독성의 연구를위한 세균및 곰팡이 병원체의 수에 대해 설립되었다, 숙주 병원체 상호 작용, 및 새로운 치료법에 대한 화면으로10,22. 다음 논의는 MTBC에 대한 감염 모델로 G. 멜로넬라의 사용에 대한 실험 절차에 기초한다.
실험 전에 순진한 애벌레의 건강은 실험의 결과에 상당한 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC)의 보조금에 의해 지원되었다, PRL및 YL에 수여 (BB / P001262/1), 및 연구에 동물의 교체, 정제 및 감소를위한 국립 센터 (NC3Rs) PRL에 수여, SMN, BDR 및 YL(NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
Referenzen
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