Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

In ihrer lytischen (aktiven) Phase kapern Herpesviren die Wirtszelle, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und Lokalisierung biologischer Moleküle führt, um Virionen zu erzeugen. Die Operationsbasis ist der Kern, in dem das doppelsträngige DNA-Virusgenom repliziert undin eine Proteinhülle, Capsid 1, verpackt wird. Zu Beginn drückt das Virus seine eigenen Proteine aus, entführt Wirtsmaschinen und verhindert die Expression von nicht-essentiellen Wirtsgenen, ein Prozess, der als Wirtsabschalteffekt bezeichnet wird. Der Großteil dieser Aktivität ist lokalisiert auf spezifische 4-,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)-freie Kernregionen, die als Viralreplikationskompartimenten bezeichnet werden und aus Wirts- und Viralproteinen, RNAs und viraler DNA²bestehen. Die Zelle wird überholt, um Platz und Ressourcen für die Replikationsräume und damit die Montage von viralen Kapsiden bereitzustellen. Sobald das Capsid den Kern verlässt, ist unklar, wie das Capsid in das Zytoplasma eingehüllt wird, um ein membrangebundenes virales Teilchen zu produzieren, das auch als Virion bekannt ist. Das Verständnis der Lokalisierung und räumlichen Verschiebungen von Wirts- und viralen Biomolekülen während der lytischen Phase bietet tiefere mechanistische Einblicke in die Anordnung des Replikationsfachs, den Wirtsabschalteffekt, den Virion-Egress-Pfad und andere Prozesse im Zusammenhang mit herpesviralen Infektionen und Replikationen.

Derzeit ist die beste Methode, um diese Veränderungen zu erkennen und zu untersuchen, die Visualisierung von Proteinen und RNAs in infizierten Zellen mit Immunfluoreszenz (IF) bzw. fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (FISH). Die Verwendung eines Zeitverlaufs mit diesen Techniken zeigt die Lokalisierung von Biomolekülen an zentralen Punkten der lytischen Phase oder einfach, raumzeitliche Daten. FISH und IF ergänzen andere biochemische Techniken, wie z. B. Hemmung eines zellulären Prozesses (z. B. Hemmung der viralen DNA-Replikation), RT-qPCR (Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion), RNA-Sequenzierung, Nordflecken, Massenspektrometrie, Western Blotting und Analyse der viralen DNA-Produktion, die ein globaleres Bild der zellulären Aktivitäten liefern kann.

Wir entwickelten RNA-FISH-Strategien, um die RNA-Produkte aus bestimmten Genen zu untersuchen, und eine Rechneranalyse, die das nukleozytoplasmatische Verhältnis eines bestimmten Genprodukts quantitativ berechnet. Die Probenvorbereitung, modifiziert aus früheren Veröffentlichungen von Steitz und Kollegen^3,4, ist relativ einfach und kann sowohl für Haftzellen als auch für suspendierte Zellen verwendet werden. Das Protokoll ist auch für den gleichzeitigen Einsatz mehrerer RNA FISH-Strategien (Double RNA FISH) oder RNA FISH mit IF-Strategien anpassungsfähig. Die Entwicklung einer spezifischen FISH-Strategie ist eine Herausforderung, aber es werden Vorschläge zur Verbesserung des Erfolgs skizziert. Die hier beschriebene Datenanalyse ist quantitativ, wenn fluoreszierende Perlen und starke Marker von Fachgrenzen verwendet werden und bietet zusätzliche Einblicke in die Mikrographen, Erkenntnisse, die Beobachtungsverzerrungen entfernen. Das detaillierte Protokoll ist sowohl für latente als auch für lytische Zellen konzipiert, die mit dem Mit dem Kaposi-Sarkat-assoziierten Herpesvirus (KSHV) infiziert sind, und kann mit nicht infizierten Zellen oder Zellen verwendet werden, die mit anderen Herpesviren infiziert sind⁵. Die Methoden der Quantifizierung sind auf Studien über nukleozytoplasmatische Verschiebungen oder Relokalisierung zwischen subzellulären Kompartimenten in den meisten Zellen anwendbar.