JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetik

עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

Published: May 19, 2019
doi:
10.3791/59652
, , , , ,
1Biological Design Center,Boston University, 2Department of Biomedical Engineering,Boston University, 3Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry,Boston University, 4Department of Bioengineering,Rice University, 5Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering,Harvard University

Summary

מסגרת החברה מאפשרת תרבות רציפה ומיקרוביאלית של תפוקה גבוהה עם רזולוציה גבוהה ושליטה דינמית על פרמטרים ניסיוניים. פרוטוקול זה מדגים כיצד להחיל את המערכת על מנת לבצע ניסוי כושר מורכב, המנחה את המשתמשים בתיכנות אוטומטי של שליטה על תרבויות בודדות, מדידת, איסוף ואינטראקציה עם נתונים ניסיוניים בזמן אמת.

Abstract

שיטות התרבות המתמדת מאפשרות לגדל תאים בתנאים סביבתיים מבוקרים, ולכן שימושיים באופן נרחב למדידת פנוטיפים לכושר ולשיפור ההבנה שלנו כיצד מעוצבים על ידי בחירה. מאמצים רבים לאחרונה לפתח וליישם נישה התקנים מתמשך התרבות חשפו את היתרונות של ניהול צורות חדשות של בקרת תרבות התא. זה כולל הגדרת לחצים בחירה מותאמים אישית ותפוקה גוברת עבור מחקרים החל האבולוציה לטווח ארוך לבחירות הגנום הרחב בחירות והגדרת מעגל גנטי סינתטי. פלטפורמת הפיתוח פותחה לאחרונה כדי לענות על הביקוש הגובר הזה: פלטפורמת תרבות רציפה עם רמה גבוהה של מדרגיות, גמישות ואוטומציה. ההתפתחות מספקת פלטפורמה יחידה היכולה להיות (re)-מוגדרת ומקנה מידה מינימלי לביצוע סוגים רבים ושונים של ניסויים בבחירת תפוקה גבוהה או רב-מימדי. כאן מוצג פרוטוקול שיספק למשתמשים את המסגרת תיאור לקביעת התצורה של המערכת לניהול ניסוי מותאם אישית של צמיחה רציפה בקנה מידה גדול. באופן ספציפי, הפרוטוקול מנחה את המשתמשים כיצד לתכנת את המערכת למגה-בתים של שתי לחצים – טמפרטורה ומססמנים-על -פני מבחנות רבות של המרכז, כדי לכמת את נופי הכושר של המוטציות הצאביסים בסדר רזולוציה. אנו מציגים כיצד ניתן להגדיר את תצורת ההתקן הן באופן תוכניתי, באמצעות התוכנה הפתוחה-מבוססת-האינטרנט שלה, ופיזית, על-ידי סידור של פלואידיג ופריסות חומרה. התהליך של הקמת המכשיר באופן פיזי, תכנות שגרת התרבות, ניטור ואינטראקציה עם הניסוי בזמן אמת באמצעות האינטרנט, דיגום דגימות לניתוח לא מקוון אחר, וניתוח נתונים לאחר ניסוי מפורטים. זה אמור לשמש נקודת התחלה עבור חוקרים ברחבי דיסציפלינות מגוונות כדי ליישם את הפיתוח בתכנון של ניסויים מורכבים שלהם צמיחה תאים התפוקה הגבוהה כדי ללמוד ולטפל במערכות ביולוגיות.

Introduction

טכניקות מתמשך של תרבות התא, שפותחה לראשונה כמעט 70 שנים לפני1,2, הם נהנים התחייה האחרונה3,4. הדבר נובע מזרימה של גורמים. ראשית, הפיתוח של טכניקות תפוקה גבוהה-omics, אשר אפשרו לקרוא וליצור מספר גדול של גנוטיפים5,6, יצרה דרישה במקביל עבור טכניקות ניסיוני המאפשרים צמיחת תאים מבוקרת היטב ופנוטיפים. לשם כך, התרבות הרציפה מייצגת גישה ניסיונית רבת עוצמה כדי לנצל את ההתקדמות הגנומית של מתהווה. על ידי הקלה על בחירות צמיחה/ניסויים על אוכלוסיות הסלולר בשליטה מדויקת (דינמי) תנאים סביבתיים, התרבות הרציפה מספק אמצעי למפות בקפדנות מיפוי כדי פנוטיפים7,8, לכימות אפיון זנים ואורגניזמים מהונדסים9, ומעקב אחר שינויים גנטיים גמישים במחקרים אבולוציה מעבדה10,11,12.

שנית, הופעתה האחרונה של שיטות אבי-טיפוס נגישים, כגון הייצור התוסף ורכיבי החומרה והתוכנה של הקוד הפתוח, אפשרה לקבוצה רחבה יותר של משתמשים לעצב ולבנות צורות חסכוניות משלהם של מערכות תרבות רציפות. ישירות במעבדה. כל זה הוביל למערך מלהיב של התקני עשה זאת בעצמך (DIY) המבצעים פונקציונליות רציפה של התרבות, כגון הכימוסטט13, turbidostat14, או morbidostat15. למרבה הצער, למרות שהצליחו לטפל בבעיות ספציפיות (נישה) שעבורן הן עוצבו, פתרונות אד-הוק אלה חסרי בדרך כלל את היכולת לשנות את התפוקה ו/או מורכבות התכנון הניסיוני.

מערכת התכנון תוכננה במטרה ליצור פלטפורמה אחת שיכולה להכיל את הצרכים הניסיוניים הגוברת של התרבות הרציפה ולהתאים את המהירות וההיקף של טכניקות גנומית של מתהווה16 (איור 1a). עיצוב הפיתוח מיישם אמונות נפוצות המשמשות לטכנולוגיות מדרגיות מאוד מדיסציפלינות אחרות17, כולל עקבות מתוקננת, רכיבים מודולריים ועקרונות עיצוב בעלי קוד פתוח. לפיכך, פתרונות ליישומי נישה חדשים יכולים להיות מתוכננים ללא שינויים משמעותיים במערכת. מורכב מאוד מודולרי ומקור פתוח, חומרה, אלקטרוניקה ותוכנה מבוססת-אינטרנט, החברה היא מערכת התרבות הרציפה האוטומטית הראשונה שיכולה להיות חסכונית ומוגדרת מחדש לבצע כמעט כל סוג של ניסוי צמיחה בתפוקה גבוהה. באמצעות שרוולים חכמים מודולריים וניתנים לתכנות, אשר מפעילים את כל החיישנים והמפעילים הדרושים כדי לשלוט בתרבויות בודדות, מאפשר באופן ייחודי שינוי גודל התפוקה והשליטה האישית בתנאי התרבות. כמו-כן, כפלטפורמה מבוססת-אינטרנט, מחליף נתונים ומידע עם מחשבים מרוחקים בזמן אמת, ומאפשר ניטור סימולטני של מאות תרבויות בודדות ותרבות אוטומטית רטבאליות באמצעות שליטה מוגדרת באופן שרירותי אלגוריתמים.

בעבודה הקודמת הפגינו הביצועים החזקים של המפעל בניסויים ארוכי טווח במאות שעות פעילות, וביכולתה לטפח אורגניזמים שונים, מ -E. coli ו- s. cerevisiae ס לבלתי מבויתים חיידקים. סדרה של ניסויים בבחירת גדילה ברורים בוצעו, שבו הוגדרו באופן תוכניתי מעברי בחירה רב-ממדי מוגדרים על פני מערך של תנאי תרבות בודדים, ואת נופי הכושר הסלולריים הנובעים היו כמת. כאן, המטרה היא לספק למשתמשי התוכנית תיאור של אופן השימוש במערכת לעיצוב וסוגים אלה של ניסויים. כדוגמה, שיטות לכמת את הנוף של מוטציות S. cerevisiae ס על פני מעבר משני מימדי הסביבה מורכב הטמפרטורה ואת הלחץ אוסמוטי מוצגים. הפרוטוקול מנחה את המשתמשים באמצעות קביעת התצורה של מסגרת התכנית לניסוי זה הן באופן תוכניתי, באמצעות התוכנה לקביעת שגרות מותאמות אישית של שגרת הטמפרטורה ובקרת הטמפרטורות עבור כל אחת מתוך 16 תרבויות רציפות מקבילות, ומבחינה פיזית, דרך הפריסה פלואידיקה לתוואי כראוי דיות של ריכוזי מלח שונים. פרוטוקול זה אמור לשמש כטבלת להערכת הישגים כללית לקביעת התצורה של התוכנית לביצוע מגוון רחב של ניסויים מתמשכים בתרבות הרציפה עבור מחקרים ודיסציפלינות שונות.

Protocol

1. הכנת המדיה, הבקבוקונים והאינוות הערה: פרוטוקול זה מניח שמשתמשים כבר כיילו את מערכת הניהול ומשתמשים בתצורה של שרוול חכם המתואר בעבודה קודמת16. שרוולים חכמים מחדש בקלות או משתנים, אך פרטי ההתקנה של פרמטרי העוצמה והבקרה עשויים להיות שונים עבור תצורות חלופיות. יום לפני הניסוי, להכין 2 mL בתרבויות נוזלי לילה של S. cerevisiae ס BY4741 התייחסות זן וזנים variant במדיה YPD (Peptone שמרים דקסטרוז) ב 30 ° c בחממה רועדת לפחות 300 r.p.m. העברת מדיה סטרילית YPD לתוך נקי, בקבוקים אוטוקלבד מצויד אבובים. לחילופין, התקשורת עשויה להיות אוטומטית ישירות בבקבוקים מראש מצויד אבובים.הערה: בקבוקים הם להתאים עם אבובים על ידי קידוח חור לתוך כובע ולהפעיל אבובים דרכו עם מחברים כדי לאבטח אותו במקום. ראה טבלת חומרים. הוסף מהומה בר לכל בקבוקון ובורג על מכסה בקבוקון מצויד זרם ו-לוקס קשיות. ודא שכל הרכיבים נקיים באמצעות בדיקה חזותית. מניחים את הבקבוקונים בארון תקשורת אוטוקלאני, מכסים בנייר כסף, ומובחנות על מחזור כבידה או ואקום עם צעד 20 דקות של עיקור. 2. הקמת ניסוי בשלושה כוסות גדולות, להכין 500 mL של 10% אקונומיקה, 200 mL של 10% אקונומיקה, ו 300 mL של 70% אתנול. באמצעות המתגים בהתקן הכלי, הפעל את 5 מספק הכוח של ה-V בדרך, המתן 5 שנים, ולאחר מכן הפעל את מספק הכוח החמישי. אם הפעלת מספר מבחנות מאותו בקבוק מדיה, חבר קווי קלט מדיה מרובים עם מפצלי צינורות. ניתן לבנות מפצלי צינורות מותאמים אישית עם רכיבי Luer. הכנס את קווי הקלט של המדיה בגביע האקונומיקה הראשון, והמדיה מתחילה להיות בתוך גביע האקונומיקה השני. הניחו את קצה הזרם של קווי הכניסה למדיה בגביע השני עם קווי האפלוקס. . הציבו את קווי הפסולת בזבל הוסף 1-2 L של אקונומיקה לתוך carboy גדול ריק אשפה, אשר לעקר פסולת שנוצר במהלך הניסוי. התייעץ עם מתאם בטיחות כדי להבטיח סילוק נאות של פסולת. באמצעות מסך המגע על התוכנית, לנווט אל מקטע ההתקנה, ולהפעיל את כל המשאבות עבור 20 s כדי למלא את קווי הנוזלים עם 10% אקונומיקה. בזמן הריצה, להבטיח על ידי בדיקה חזותית כי כל הקווים מולאו והמשאבות פועלים כרגיל. אפשר אקונומיקה לשבת בקווים עבור לפחות 30 דקות כדי לחטא. הפעל משאבות שוב באמצעות יישום מסך מגע עד שהשורות כבר לא מתחת למים, דוחף אוויר דרך הקווים כדי לקבל כמה מלבין החוצה ככל האפשר. מניחים קווי קלט מדיה בגביע האתנול וחוזרים כמו למעלה, ממלאים את הקווים באתנול ושטיפה באוויר.הערה: כמו אתנול הורג מהר, אין צורך לחכות 30 דקות עבור עיקור. הצמד קווי קלט מדיה לבקבוקי המדיה עם מחברי Luer והפעל את המשאבות עד שהתקשורת תפעל באופן מלא דרך הקווים, ורוקן את כל האתנול שיורית. הכנס באופן חלקי את הבקבוקונים לתוך השרוולים החכמים וחבר את הקווים לעמדות המתאימות, בהתאם לקידוד הצבע בקווים. התחל על-ידי הצמדת קווי קלט למקש הזרימה הקצר, ולאחר מכן פסולת קווים לקשית הארוכה.זהירות: קריטי לבדוק אם יש חיבורים רופפים או קווים שנותבו באופן שגוי. כישלון לעשות זאת יגרום מגולשת ועלולים לגרום נזק השרוול חכם. הפעל את כל המשאבות במרווחים של 10 s כדי למלא את הבקבוקונים במדיה. להבטיח על ידי משאבות בדיקה חזותית להסיר ביעילות הסרת מדיה דרך הקשיות, כדי למנוע גולשת. אם הקשיות מופיע לא לתפקד ביעילות, לבדוק את החיבורים קו פלואידיc ואת המשאבה הפריסטלטית. תקן או החלף חלקים לפי הצורך. דחפו את הבקבוקונים למטה עד. שהוא עטוף לגמרי בשרוול החכם הגדר את התנאים ההתחלתיים עבור פרמטרים ניסיוניים באמצעות מסך המגע של התוכנית בעמוד ההגדרה האינטראקטיבית. עבור כל הבקבוקונים, הגדר את הטמפרטורה ל -30 ° c ומערבבים ל -10. ניתן לעשות זאת עבור כל הבקבוקונים בבת אחת על ידי גרירת אצבע על פני מסך המגע כדי לבחור את כל הבקבוקונים. 3. קביעת התצורה של תוכנת הפיתוח ושגרת התרבות האלגוריתמית בלוח המחוונים של המחשב, נווט אל הדף של מנהל הניסוי. בחרו בניסוי הבסיסי בחלונית ‘ נווט הניסוי ‘ או בניסוי קיים כנקודת התחלה ולחצו על ‘ שיבוט חדש ‘.הערה: ניתן להשתמש בניסויים מקבוצות אחרות על ידי הדבקת הקישור GitHub לריפו שבו ההגדרה הניסיונית נשמרת לתוך מנהל הניסוי. ציין את שם הניסוי ואת התקן הניהול שהניסוי יפעל עליו. ודא שהגדרות הכיול הרצויות נבחרו על-ידי שינוי שדות אלה בעמוד. השתמש בבורר המבחנה ובחלוניות הגדרת הפרמטרים כדי לקבוע תנאים ניסיוניים. לדוגמה, כדי להגדיר את הטמפרטורה עבור מבחנות 0-4 עד 30 ° צ’, בחר את הבקבוקונים בבורר הבקבוקון, הגדר את הגדרת הפרמטר ל-30 ולחץ על set. חזור על פעולה זו כדי להגדיר סף עליון ותחתון עבור כל בקבוקון. לאחר השלמת הגדרות פרמטרים ניסיוניים, שמור את הניסוי על-ידי לחיצה על שמור ולחץ על התחל לפעול. 4. ייזום ניסוי וניטור בזמן אמת לאחר שהניסוי מתנהל, נווט ללוח הנתונים בזמן אמת בלוח המחוונים האינטראקטיבי. עבור כל בקבוקון, בדוק שערכי ה-OD מחזיקים באפס, והטמפרטורות נמצאות או מתקדמות לעבר רמות מתוכנתים על-ידי עיון בגרפים. כדי להכין את האירשת, למדוד את ה-OD של תרבויות לילה, לחשב את הדילול קיפול הרצוי בהנחה נפח בקבוקון של 25 מ ל, ואת הנפח המחושב מחושב של לתוך מבחנות דרך יציאת הדגימה. לדוגמה, כדי להגיע למטרה ההתחלתית הרצויה של כ 0.05 בבקבוקון התרבות מתרבויות לילה כי הם ב-OD 2.0, 625 μL של תאים יש להוסיף לכל בקבוקון. בדוק את הגרפים בלוח המחוונים כדי לראות שתרשימי ה-OD עודכנו בהתאם. יש לראות בגרפים את העליה הקרובה להתחלת ההתחלה הרצויה. מעקב אחר סוגי נתונים שונים (כגון OD, טמפרטורה, קצב צמיחה, דורות וצריכת מדיה) במהלך הניסוי על-ידי עיון בגרפים המתאימים בלוח המחוונים. ערכים אלה עשויים ליידע את ההחלטות הנסיוניות על-ידי המשתמש (למשל, לתזמן נקודות זמן) או אפילו להשתמש בפונקציות לביצוע משוב אוטומטי. כדי להחליף בקבוקי מדיה באמצע ניסוי, השהה את הניסוי בלוח מנהל הניסוי כדי למנוע התרחשות של אירועי משאבה. להתיר במהירות את קו המדיה מהבקבוק הריק ולחבר אותו לבקבוק החדש. להימנע מלגעת בקצוות של אבובים כדי למנוע זיהום. . לחדש את הניסוי במנהל הניסוי 5. דגימת תאים שמרים מתוך הבבחנות הכינו פתרון cycloheximide כדי לעכב את סינתזה החלבון ולתקן תאים שמרים עבור הניתוח cy, מנסה לזרום. בצינור 15 מ”ל, הוסף 12 מ ל של PBS ו 12 μL של 20 מ”ג/mL cycloheximide ומערבולת עבור 5 s. באמצעות הצנרת רב-ערוצי, סדרת מחלקים 100 μl לתוך כל טוב של הצלחת 96-היטב עגול התחתון. לעטוף את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור ולשמור על 4 ° צ’ עד הצורך. כדי לדגום, פיפטה דרך יציאת הדגימה על מכסה הבקבוקון באמצעות אורך מורחב 200 μL טיפים. פיפטה 100 μL ממבחנה לתוך באר בצלחת הקיבעון, ערבוב 2-3x על ידי ליטוף למעלה ולמטה, לאחר מכן להתאושש בנייר כסף ולהחזיר את הצלחת 4 ° c. 6. הניסוי לשבור ולנקות הכינו 1 L של 10% אקונומיקה ו 2 500 mL די פתרונות מים בספלים גדולים. עצור את הניסוי על-ידי שליחת הפקודה stop בלוח מנהל הניסוי. הנתונים עדיין מאוחסנים במסד הנתונים המותאם לענן הצמתים, וניתן עדיין להציגם בהמשך בלוח הנתונים בזמן אמת שבלוח המחוונים, או להוריד אותם לניתוח לא מקוון. הסירו מבחנות משרוולים חכמים והניחו אותם במדף החיטוי כדי להימנע מגולשת בצעדים הבאים. להתיר את קווי הקלט של התקשורת מבקבוקי המדיה ולמקם אותם בגביע של 10% אקונומיקה. הפעל משאבות מממשק המשתמש של התוכנית כמו בהתקנה כדי לעקר קווים ומבחנות. נתק קווים מבקבוקונים ושורות במים של די. הפעל משאבות לשטוף את כל האקונומיקה מתוך המערכת הראשונה עם מים DI, ואז עם האוויר. בטל את הדרך על-ידי החלפת הספק החשמלי של 12 המבקרים, המתנה 5 s ולאחר מכן כיבוי ה-5 מספק הכוח החמישי. משרים ברים מערבבים וכובעים ב -10% אקונומיקה, ולאחר מכן לשטוף עם מים DI. להיות בטוח לשטוף את הקשיות של זרם ו-לוקס של כל כובע על ידי הפעלת מים DI דרכם. קרצוף בדיקות שימוש במברשת שפופרת בדיקה אם הסרט נוצר על קירות. להיפטר פסולת כראוי ולשטוף מיכלי פסולת ביסודיות.זהירות: מיכלי פסולת יכיל תערובת של 10% אקונומיקה, התרבות תא מעוקר פסולת וכמויות מעקב של אתנול. התייעצו עם מתאם בטיחות לטיפול וסילוק נאות. 7. כולל כושר באמצעות זרימה Cyהתנסה לנתח אוכלוסיות חלקיות לנתח דגימות שנאספו מסעיף 5 באמצעות cytometer זרימה מצויד ערוץ הזריחה המתאים גלאים16. לרכוש לפחות 10,000 אירועים לכל מדגם, ושער עבור תאים שלמים באמצעות נתוני פיזור הקדמי והצד. שער המבוסס על ערוץ הזריחה המתאים (g. GFP) כדי לקבוע את התפלגות השבר של כל אוכלוסיה. במחשב, שמור נתונים למיקום הרצוי מהעמוד ‘ מנהל הניסויים ‘ על-ידי לחיצה על לחצן “ייצוא”. מקבצי הנתונים של הקובץ, קבע את מספר הדורות שהושלמו בכל נקודת זמן עבור כל בקבוקון. בקוד ההתפתחות, הדורות מחושבים באופן ראשוני את נתוני ה-OD בין כל אירוע דילול, ולאחר מכן כל פלח מתאים למעריך בסיסי של הטופס לכל פלח, מניב r, שיעור הצמיחה16. לאחר מכן, מספר הדורות במהלך תקופת זמן מחושב באמצעות הנוסחה הבאה: מתווה את יחס היומן של האוכלוסיות המסומנות בתוויות ובלתי מסומנות מתוך הזרימה cy, try data vs מספר הדור מתוך החישובים הנ ל בדגימות הזמן נלקחו. זהה את האזור הליניארי והתאם את השיפוע בהתאם למשוואה הבאה. מדרון זה מוגדר בדרך כלל ככושר תחרותי18,19.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן שימש כדי לבנות מפות כושר עבור גרסאות גנטיות של S. cerevisiae ס על פני מעבר לחץ דו מימדי של טמפרטורה ומליחות. באופן ספציפי, עבור כל זן משתנה, השתמשנו באפשרות הארגון לבצע ניסויים זיווגים התחרות נגד מאמץ התייחסותfluorescsiae (שBY4741 מאמץ משולב עם כתב מסוים בחוקה כתבת ירוק) ב 16 שונים צירופים של מלחצים אלה (איור 1). עבור משתנים, שני זנים הנוקאאוט נבחרו כל ניבא להיות רגיש לאחד צירי מצב הלחץ: ΔPRX1 אשר דווח כי יש פגמים כושר בטמפרטורות גבוהות20 ו ΔPBS2 עם מומים כושר ברמה גבוהה ריכוזי מלח21. כמשתנה בקרה, נעשה שימוש בנבג BY4741 מסוג פראי ללא תווית, שצפוי להופיע באופן דומה לנבג הייחוס. בסך הכל, ניסויים אלה ב3 72 בשעות היום נערכו בו ב-48 בבקבוקונים על פני שלושה מתקני הרובר (16 בקבוקון) הפועלים ממחשב יחיד. לוח המחוונים האינטראקטיבי של התהליך משמש לניווט בכמות הנתונים הגדולה שנוצרת במהלך כל ניסוי (איור 2A). באיור 2Bמופיעים עקבות מייצגים של כל 16 הבקבוקונים של מכשיר מעבר אחד. כל מעקב מציג תבנית מסורבית אופיינית מאלגוריתם הבקרה turbidostat, אשר משתמש משוב על OD כדי להפעיל מדלל ולשמור על תרבויות בטווח צפיפות צרה (0.2-0.3 במקרה זה). נתוני ה-OD והטמפרטורה נמדדים באופן רציף, מוזרמים למסד הנתונים המותאם לענן צמתים ומעודכן בזמן אמת בלוח המחוונים האינטראקטיבי של האתר. החל מזרם נתונים, מדדים בסדר גבוה יותר (למשל, שיעור צמיחה, דורות מצטברים) ניתן לחשב ולהתוות בלוח המחוונים (איור 2C) ואפילו לשמש כפרמטרי משוב בערכות בחירה שונות (למשל, morbidostat). כדי ליצור מפות כושר, אנו מודדים את הקצב בו המתח התייחסות מתחרה את הזן משתנה על ידי שילוב שתי מדידות cy, לנסות הזרימה ונתונים הצמיחה התפתחות. באופן ספציפי, שברים באוכלוסיה מחושבים כיחס היומן של מאמץ משתנה על פני מאמץ התייחסות באמצעות cy, הזרמת נתונים מכל מדגם של נקודת זמן. עבור כל תרבות ונקודת זמן, מספר הדורות שחלף מגיע לאינטרפולציה מנתוני קצב הצמיחה של התפתחות בכל תקופת דילול. התוויית יחסי היומן על הדורות, הבדלים איכותניים בין התנאים מתחילים לצוץ (איור 3A). כדי לחשב את הכושר, מדרון מתאים לחלק הליניארי של כל חלקה18,19, מניב ערך כמותי (עם השלט והתעריף) המתאר כיצד הנבג זן מתחרה נגד זן הייחוס ( איור 3 ב). בניסוי זה, ערכי כושר שליליים עולה כי הזן משתנה מתחרה על ידי מאמץ ההפניה. בניית מפות החום מכל חישובי הכושר מאפשרת ויזואליזציה של נוף דו מימדי כושר, חשיפת הבדלים כמותיים עדינים בביצועים בין זנים ומצבים (איור 3C). מתוך מפות הכושר, אנו רואים שכל אחד מהזנים מציג פגמים בכושר המניפסט בדרכים שונות. ΔPRX1 הוא רגיש בעיקר לטמפרטורות גבוהות, אבל הלחץ מלח נראה השפעה מתוסף, הגדלת מום הכושר. לעומת זאת, ΔPBS2 מראה פגמים בכושר בעיקר בתגובה לריכוזים גבוהים של מלח, עם הבדלים מינימליים לאורך ציר הטמפרטורה. תוצאות אלה מדגישות את השירות של ניסויים בבחירה ברזולוציה גבוהה במיוחד לפענוח אינטראקציות של מספר מחצים סביבתיים, אשר יכול להיות תוסף, סינגיסטי או אפקטים אפיסטטיים. לבסוף, חשוב לציין כי במקרים מסוימים, במיוחד למצבי לחץ חמורים, חישובי כושר עלולים להוביל לתוצאות מוגזמות או מוטות. לדוגמה, ΔPBS2 נראה להראות מדרון חיובי תלול במצב 39 ° c/1 M היום ביחס למתח ההפניה (איור 3a). זה מיוחס לצמיחה ירודה של שני זנים, אשר משתקף בנתונים סוג פראי ומגביל את השירות של מדד מסוים זה במצב זה. מספר מספיק של דורות תוצאות 1) הפרדה עלובה של נקודות זמן אשר מפריעה עם התאמת מדרון, ו 2) רגישות להשפעות סטוכסטיים שמקורם שלב השהיה. בעוד לא בחרו לעשות זאת במחקר זה, הנתונים הצמיחה בזמן אמת שנאספו על ידי התפתחות במהלך הניסוי היה יכול לשמש כדי ליידע את ההחלטה להאריך את הניסוי ולאסוף נקודות זמן נוספות עבור מצב זה עם מעט מאמץ. בניסויי מעקב, יחסי התחלתי יכולים גם להיות מאופנן כדי להאריך את אורך האזור הליניארי לפני שהרוויה מתרחשת. איור 1: מבט כולל על מסגרת הפיתוח והתכנון הניסיוני. (א) הינה פלטפורמה אוטומטית ורציפה לתרבות המאפשרת שליטה מרובת פרמטרים בתנאי התרבות. הפלטפורמה כוללת שרוולים חכמים, אשר הבית החיישנים ומפעילים לשליטה בתנאי התרבות, מערך משאבה פריסטלטי עבור מדיה זורמת ופסולת של התרבויות, מסך מגע לאינטראקציה ידנית עם המכשיר, ומחשב שמשת לאינטראקציה עם תשתית הענן שבה נתונים מהפלטפורמה מוזרמים. (ב) ניתן לקבוע את התצורה בדרכים מרובות: פיזית, באמצעות כניסות תאים ומדיה, ובאופן תוכניתי על-ידי התאמת האלגוריתמים השולטים במודולים של בקבוקון תרבותי שרוול חכם. זה יכול להיות מנוצל לתוכנית בחירה רב מימדית/סביבתי מעברי ברזולוציה גבוהה, עם תפוקות המורכב תאים שנאספו פיזית בנקודות זמן מוגדרות בזמן אמת הזרמה של נתוני התרבות. (ג) הגדרת ההתפתחות לערוך ניסוי כושר גדילה על פני הדרגתי בחירה דו מימדית, המורכב מטמפרטורה ומאוסמוטי לחץ. מבחנות התרבות של החברה הופרה בפרופורציות שוות של התייחסות ושמרים משתנה. שגרת turbidostat תוכננה לשמור את כל התרבויות בשלב מעריכי בחלון OD מוגדר (OD 0.2-0.3). הטמפרטורה ותנאי התקשורת היו מגוונים לאורך המערך שרוול חכם כדי ליצור שני מעברי לחץ עצמאיים. מדיית הבסיס הייתה מורכבת מ-YPD (2% גלוקוז) + 100 μg/mL carbenicillin + 25 μg/mL כלורמפנול כאמצעי זהירות כנגד זיהום חיידקי. קומפוזיציות מדיה היו מגוונות על ידי הוספת משלים משלימים ל -0 מ ‘, 0.6 M, 0.8 M, או 1.0 M. בבקבוקון הטמפרטורות תוכנתו לאחד מארבעה ערכים: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c, או 39 ° c. (ד) דוגמאות לתפוקה גולמית עבור התרבות OD ושברי האוכלוסיה משלושה תנאים שנבדקו. ניסוי התחרות נשמר ל72 h, הדגימה 24 שעות ולאחר מכן כל 12 שעות עד לסיום הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: לוח מחוונים לניתוח נתונים בזמן אמת. (א) נתוני היישום מעובדים ומוזרמים בזמן אמת באמצעות תוכנה המבוססת על ענן צמתים ללוח מחוונים אינטראקטיבי. באמצעות לוח המחוונים, משתמשים יכולים להגדיר וליזום שגרת התרבות שלהם על מערכת הפעלה מחוברת, לנטר את הניסויים הפועלים כעת על פני כל יחידות המעבר, ולשנות את התנאים הניסיוניים באופן ידני על בקבוקון בודד או קבוצה של מבחנות במידת הצורך. (ב) עקבות עבור כל בקבוקון על פני מטריצת התנאים שנבדקו למשך הניסוי כולו. ניתן להציג רשמים בזמן אמת כדי לוודא שהניסוי פועל כנדרש ובשימוש לאחר ניסוי לצורך ניתוח נוסף. (ג) קצבי הצמיחה והדורות הסלולריים יכולים להיות מחושבים מעקבות ה-OD בטיסה כדי לעקוב אחר התקדמות הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: בניית משטחי כושר. (A) שברים של האוכלוסייה הטבעיתיומן הרישום (זן משתנה/הפניה זן) מותווים נגד דורות התאים. ‘ צבע ‘ מציין את טמפרטורת הבחירה בזמן שמקפים מבדילים בין ריכוזי המלח. (ב) לכמת את הכושר היחסי של המשתנה למתח ההתייחסות, מדד כושר נגזר מקצב שבו שבר האוכלוסייה התאית משתנה לאורך דורות. מדד זה מחושב מתוך האזור הליניארי של מגרשים השבר הסלולרי באמצעות מינימום של שלוש נקודות. (ג) מדדי הכושר היחסיים מוצגים במפת החום כדי לבנות משטח כושר על מעברי הלחץ הסביבתיים. מצב הפינה הימנית העליונה (39 ° צ’/1.0 M) עבור סוג פראי ו ΔPBS2 אינם כלולים בניתוח זה כאשר התרבויות עברו מספיק דורות (ראה תוצאות מייצגים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בחירת גדילה היא כלי הכרחי בביולוגיה, המשמש באופן נרחב כדי ליצור ולאפיין הבדלים פנותאריים בין אוכלוסיות סלולריות. בעוד תרבויות אצווה לאפשר בחירת גדילה באופן מוגבל, טכניקות תרבות רציפה להרחיב באופן דרמטי את מידת השליטה ואת החיזוי של ניסויים אלה, על ידי הפעלת רגולציה מדויקת על הטופס ודינמיקה של בחירה כדי ליצור לשחזור, תוצאות כמותי22. תרבות רציפה הועסק בחירת בקרת בקפדנות עבור ספריות מגוון גבוה20,23,24,25, וליישם משטרים גמישים מתוחכמים בניסויים ו . אבולוציה מכוונת,11,12,26,27 התרבות המתמשכת גם מאפשרת אפיון מדויק של תאים על פני מערך של תנאים מבוקרים לכמת כדי להבין טוב יותר מערכות גנטיות מורכבות ולייעל הנדסה ביורוביזציה זנים9,14 , . עשריםושמונה

עם זאת, אין פרוטוקול אוניברסלי לתרבות רציפה, כמו שינויים עדינים התנאים סלקטיבי יכול להוביל שינויים דרמטיים בתוצאות ביולוגיות4,29,30. על הניסויים להיות מסוגלים לבחור בין משטרי בחירה ולהתאים את הפרוטוקולים והציוד הנסיוני בהתאם. בנוסף להצעת בחירה בין פרמטרים לבקרה, מערכות כאלה יהיו מתוחכמות מספיק כדי לנהל באופן עצמאי מספר פרמטרים בו בניסויים מקבילים מאוד הדרושים כדי לפענח תשומות לאינטראקציה במתחם מערכות ביולוגיות (כגון אפיסטזיס). התוכנית מטפלת באתגר זה בכך שהיא מאפשרת למשתמשים לבחור באופן שרירותי בבקרת משוב בין תנאי תרבות לבין פונקציות פלואידיc כדי לציין נישות סביבתיות מיוחדות במיוחד.

כדי להתגבר על המגבלות של ההתקנה הנוכחית ולהרחיב או לשנות את פרמטרי השליטה, השרוול החכם יכול בקלות להיות מחדש כדי להוסיף חיישנים חדשים או מפעילים. בנוסף, הפחתת נפח המבחנה תקטין הוצאות מדיה, שיכולות להיות משמעותיות בתרבות רציפה. בעוד העיצוב הנוכחי מאפשר מדידה ושליטה של טמפרטורה, התרבות עצבנות, אינדוקציה אור, העכירות, ו פלואידיקה, פרמטרים אחרים יש למדוד חיצונית על ידי דגימה מן הבקבוקונים. העבודה הנוכחית כוללת שילוב היכולת לנטר פעילות אנזימטית באמצעות לוציפראז ולווסת את החמצן ו-pH המומסים ישירות בתרבויות הדרך. בנוסף, בעוד לא הפגינו בעבודה זו, הדרך יכולה להיות ממשק עם ריבוב הרומן מיליפלוג מכשירים16 כי לצייר על עקרונות של אינטגרציה בקנה מידה גדול (שמקורם אלקטרוניקה ואימץ על ידי microfluidics) כדי ל ביוקר לאפשר טיפול בפלואידיג מורכבים יותר (לדוגמה, כניסות פלואידיסי, העברות בקבוקון-עד-בקבוקון). מודולים אלה מודול עשוי להיות מעוצב ומיוצר לחלוטין במעבדה, ומאפשר למשתמשים לנתב נוזלים על ידי הגשמה באופן תיכנותי שילובים שונים של שסתומים ברוטינות פלואידים אוטומטית. זה מאפשר למשתמשים להתגבר על עיצובים פלואידים נוקשה המשמשים באופן מסורתי בתרבות רציפה, אבל גם בקנה מידה יכולות פלואידיc כדי תפוקה גבוהה עם מספר קטן יותר של רכיבי בקרה יקרים (למשל, משאבות פריסטלטיות). לבסוף, אנו מקווים לשלב פלטפורמת דגימה אוטומטית אשר לנצל אלה מיליפלואידיקה ו-DIY רכיבים, התגברות על המגבלה של אינטראקציה ידנית במהלך ניסויים ארוכים יותר, שבו תרבויות דגימה יהיה מסורבל.

בנוסף לשינויים פיזיים בפלטפורמה, התוכנה מבוססת-האינטרנט פותחת דרגות חופש חדשות על-ידי מתן אפשרות למשתמשים לכתוב, לערוך ולשתף סקריפטים מותאמים אישית של התוכנית, ליצור אוטומטית תוכניות ליצירת משוב, לדוגמה, ליישומי תרבות (למשל, turbidostat). משתמשים יכולים לטאטא באופן תוכניתי בין טווחי פרמטרים בווריאציות עדינות על אותה ערכת בחירה או לחבר אלגוריתמי בקרה בצירופים חדשניים כדי לציין מספר כלשהו של ערכות בחירה מתוחכמות. יתר על כן, היכולת לפקח בקלות על תרבויות בזמן אמת הופך את הדרך שבה ניסויים מתנהלים. עם ניטור בזמן אמת, משתמשים יכולים 1) לבדוק את העקביות בין הריצות, תכונה קריטית עבור יישומים ביוביודויון וניסויים בתפוקה גבוהה, ו 2) להתערב במהלך ניסויים אם יש צורך, כדי לפתור זנים מאתגרת המוצג צמיחה ירודה או היווצרות המבנה, או לאבחן שגיאות משתמש (למשל, זיהום). לבסוף, עם מספר זרמי נתונים שנאספים ומפורשים בזמן אמת עבור כל תרבות בודדת, מייצרת החברה צפיפות גבוהה של נתונים, העשויה להקל על גישות הלמידה של המחשב לניתוח הזרם.

מעבר להדגים שימושים באפיון כושר, בחירת ספריות והתפתחות מעבדה, אנו רואים מספר שדות קשורים בשלים למימוש בהתפתחות עם פלואידיקה משולבת. הניסויים הרוחיים עם דגימות microbiome יכול לאשר את יציבות הקהילה בסביבות מבוקרת31,32, לחקור הרכב microbiome באמצעות שיטות ומינים של החברה33, או מיני לערבב באופן דינאמי כדי ל לחקור דינמיקה אקולוגית של הקולוניזציה או הפלישה34,35. שיטות רבות עבור האבולוציה מכוונת רציפה של biomolecules יכול בקלות להיות מיושם על המכשיר כמו גם26,36,37, מאוד הגדלת נגישות ותפוקה של מערכות אלה. היכולת לייעל את התנאים הגוברת כגון הרכב המדיה, טמפרטורה, וזנים דינמי, תפוקה גבוהה הטבע יכול לסייע במאמצי אופטימיזציה עבור יישומים ביואנויום התעשייה9. אנו מאחרים לדמיין באופן אנכי שילוב התפתחות עם טכניקות ניתוח אחרות כגון מיקרוסקופ וזרימה cy, לולאה באופנה הלולאה הסגורה, מתן מערכת אוטומטית לחלוטין לצמיחה וניתוח של תרבויות סלולר בשני תאים ואוכלוסייה אחת רמות. יתר על כן, עם כמה שינויים בחומרה לשרוול חכם, כגון איטום כלי הקיבול ושליטה בתכולת הגז, ניתן להתאים את ההתפתחות לצמיחה של מגוון רחב יותר של סוגי תאים, כגון תאי היונקים ההשעיה. זה גם אפשרי למקם את המסגרת כולה לתוך תא אנאירובי עבור תרבות התא אנאירובית. במבט קדימה, אנו מכוונים לבנות את מסגרת התוכנה שלנו לתוך תשתית ענן מרוכזת ולהאמין שזה יאפשר למשתמשים בקלות להגדיר, לנתח, ולשתף את הנתונים שלהם מרחוק ללא צורך להיות נוכח פיזית במעבדה. מתפקד כאוצר נתונים, תשתית ענן גם להשאיל את עצמה בקנה מידה גדול המטא ניתוח ברחבי ניסויים. אנו מצפים כי ההתפתחות וההתקדמות העתידית הזאת תרחיב במידה ניכרת את היקף הניסויים האפשריים של בחירת הגדילה על ידי הקלה על אוטומציה וחדשנות בתרבות המתמשכת.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ל-סטאפורד על עזרתו בעיצוב המערכת, ו-ח’ ח’ליל, א. סטאננזדה, א. שמש, ס. Pipe ו-A. Cavale לקבלת עזרה בבניית המערכת. אנו מכירים במכון לעיצוב האלקטרוניקה (חה כ), מרכז לחדשנות במוצר הנדסי (EPIC), והתוכנה & המעבדה לחדשנות יישומים (מפרש) במרכז חרירי למחשוב באוניברסיטת בוסטון עבור שירותיהם. עבודה זו נתמכת על ידי פרס קריירה NSF (MCB-1350949 כדי A.S.K.), ו DARPA מענקים HR0011-15-C-0091 HR0011-18-2-0014 (כדי A.S.K.). A.S.K. מודה גם מימון החדש של הבמאי NIH החדשה (1DP2AI131083-01), הפרס האקדמי של הפקולטה הצעיר (D16AP00142), ו NSF משלחות במחשוב (CCF-1522074).

Materials

5 Gallon Plastic Hedpack with cap Midwest Brewing and Winemaking Supplies 45-56Y8-E2FR For waste collection
a-D(+)-Glucose Chem-Impex 00805 For YPD Medium
Attune NxT Autosampler Thermo Fisher Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Used to determine population fractions via single cell fluoresence
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118-07-0 For YPD Medium
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648250 For YPD Medium
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature McMaster- Carr 5121K731 For media input branching
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 For YPD Medium
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 Fisher Scientific 50371500 For Sterilization of fluidic lines
Custom eVOLVER vial lid FynchBio Lid has ports for sampling and fluidic input/output
Cycloheximide Fisher Scientific ICN10018301 For flow cytometry sampling plates
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4 For sterilization of fluidic lines
eVOLVER Unit FynchBio
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) Fisher Scientific 02-681-420 For vial sampling
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars Fisher Scientific 14-513-57 Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap Fisher Scientific FB8002000 Must be fitted with tubing
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD McMaster- Carr 51135K73 For media bottles
Mac Mini Apple For running the experiment/collecting data
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP243820 For flow cytometry sampling plates
Pipettes Eppendorf
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K141 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K144 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K291 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K294 For media bottles
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN Chemglass CG-4910-04 Culture vials
Sodium Chloride (NaCl) Fsher Scientific S271-3 For YPD Medium
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices For measuring OD600 of overnight cell cultures
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 Chemglass CG-4902-08 Culture vials
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500 For YPD Medium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
  2. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
  3. Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
  4. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  5. Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
  6. Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetik. 200 (2), 619-631 (2015).
  7. Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
  8. Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  9. Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
  10. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
  11. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
  12. Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetik. 206 (2), 1153-1167 (2017).
  13. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
  14. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
  15. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  16. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  17. Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance – WOSP ’00. , 195-203 (2000).
  18. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).
  19. Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).
  20. Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
  21. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
  22. Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
  23. Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  24. Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
  25. McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536 (2018).
  26. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  27. Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
  28. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).
  29. Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).
  30. Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
  31. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42 (2015).
  32. Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
  33. Lagier, J. -. C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
  34. Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
  35. Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
  36. Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051 (2016).
  37. Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).

Tags

EVOLVERAutomated Cell Growth ExperimentsHigh-throughputContinuous CultureAerobic CulturingBacteriaYeastAnaerobic FermentationMammalian CellsMedia PreparationSterilizationFluid LinesPumpsTouchscreenSetupPython CustomizationSensorsVisual Guide

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Heins, Z. J., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Wong, B. G., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER. J. Vis. Exp. (147), e59652, doi:10.3791/59652 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image