تصميم الألى ، عاليه الانتاجيه ، والمستمر تجارب نمو الخلايا باستخدام ايفولفير
Summary
يتيح اطار ايفولفير للثقافة الميكروبية المستمرة عاليه الانتاجيه بدقه عاليه وتحكم ديناميكي علي المعلمات التجريبية. يوضح هذا البروتوكول كيفيه تطبيق النظام لاجراء تجربه اللياقة البدنية المعقدة ، وتوجيه المستخدمين علي برمجه التحكم الألى علي العديد من الثقافات الفردية ، وقياس ، وجمع ، والتفاعل مع البيانات التجريبية في الوقت الحقيقي.
Abstract
وتمكن أساليب الاستزراع المستمر الخلايا من النمو في ظل الظروف البيئية المضبوطة كميا ، التالي فهي مفيده علي نطاق واسع لقياس الأنماط الظاهرية للياقة البدنية وتحسين فهمنا لكيفيه تشكيل الأنماط الجينية عن طريق الاختيار. وقد كشفت الجهود المكثفة التي بذلت مؤخرا لتطوير وتطبيق أجهزه الثقافة المستمرة المتخصصة فوائد اجراء اشكال جديده من السيطرة علي ثقافة الخلية. ويشمل ذلك تعريف ضغوط الاختيار المخصصة وزيادة الانتاجيه للدراسات التي تتراوح من التطور التجريبي الطويل الأجل إلى اختيارات المكتبة علي نطاق الجينوم وتوصيف الدوائر الجينية التركيبية. تم تطوير منصة ايفولفير مؤخرا لتلبيه هذا الطلب المتزايد: منصة الثقافة المستمرة مع درجه عاليه من القابلية للتوسع ، والمرونة ، والاتمته. يوفر ايفولفير منصة موحده واحده يمكن ان تكون (أعاده)-تكوينها وتحجيمها مع الحد الأدنى من الجهد لأداء العديد من أنواع مختلفه من التجارب العالية الانتاجيه أو متعددة الابعاد الاختيار النمو. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتزويد مستخدمي اطار ايفولفير وصفا لتكوين النظام لاجراء تجربه النمو المستمر علي نطاق واسع العرف. وعلي وجه التحديد ، فان البروتوكول يرشد المستخدمين حول كيفيه برمجه النظام لتعدد ضغطين الاختيار-درجه الحرارة و الاسموليه-عبر العديد من قوارير ايفولفير من أجل تحديد المناظر الطبيعية اللياقة البدنية من المسوخ سيرميميسسيس سيريفيسياي في غرامه القرار. ونعرض كيف يمكن تكوين الجهاز برمجيا ، من خلال برامجه المفتوحة المصدر علي شبكه الإنترنت ، وفعليا ، عن طريق ترتيب التخطيطات الفلورية والاجهزه. عمليه اعداد الجهاز ماديا ، وبرمجه روتين الثقافة ، والرصد والتفاعل مع التجربة في الوقت الحقيقي عبر الإنترنت ، وقنينات أخذ العينات للتحليل اللاحقة دون اتصال ، وتحليل بيانات التجربة بعد ذلك مفصله. وهذا ينبغي ان يكون بمثابه نقطه انطلاق للباحثين عبر مختلف التخصصات لتطبيق ايفولفير في تصميم الخاصة بهم معقده وعاليه الانتاجيه تجارب نمو الخلايا لدراسة والتلاعب النظم البيولوجية.
Introduction
تقنيات الخلية المستمرة الثقافة ، وضعت لأول مره تقريبا 70 منذ1،2، وتتمتع احياء الاخيره3،4. ويرجع ذلك إلى التقاء العوامل. أولا ، ان تطوير تقنيات إنتاجيه عاليه ، والتي جعلت من الممكن قراءه وتوليد اعداد كبيره من الأنماط الجينية5،6، خلقت الطلب المصاحب للتقنيات التجريبية التي تسهل نمو الخلايا التي تسيطر عليها جيدا والتنميط الظاهري. وتحقيقا لهذه الغاية ، تمثل الثقافة المستمرة نهجا تجريبيا قويا للاستفادة من التقدم الجيني الناشئ. من خلال تسهيل اختيارات النمو/التجارب علي السكان الخلويين في الظروف البيئية التي تسيطر عليها بدقه (وديناميكية) ، توفر الثقافة المستمرة وسيله لتحديد الأنماط الجينية بدقه إلى الأنماط الظاهرية7،8، وصف كميات السلالات المهندسة والكائنات9، وتتبع التغيرات الوراثية التكيفيه في دراسات تطور المختبرات10،11،12.
وثانيا ، مكن ظهور تقنيات النماذج الاوليه التي يمكن الوصول اليها مؤخرا ، مثل التصنيع المضاف وعناصر الاجهزه والبرمجيات المفتوحة المصدر ، مجموعه أوسع من المستخدمين من تصميم وبناء اشكال النظم الثقافية المستمرة الخاصة بهم والفعالة من حيث التكلفة مباشره في المختبر. وقد ادي كل هذا إلى مجموعه مثيره من تفعل ذلك بنفسك (DIY) الاجهزه التي تؤدي وظائف الثقافة المستمرة ، مثل chemostat13، turbidostat14، أو morbidostat15. ومن المؤسف ان هذه الحلول المخصصة ، رغم نجاحها في معالجه المشاكل المحددة (المتخصصة) التي صممت من أجلها ، تفتقر عموما إلى القدرة علي التوسع في الانتاجيه و/أو تعقيد التصميم التجريبي.
تم تصميم نظام ايفولفير بهدف إنشاء منصة واحده يمكنها استيعاب الاحتياجات التجريبية المتزايدة للثقافة المستمرة ومطابقه سرعه ونطاق التقنيات الجينية الناشئة16 (الشكل 1a). ويطبق تصميم ايفولفير المبادئ المشتركة الكامنة وراء التكنولوجيات القابلة للتطوير العالي من التخصصات الأخرى17، بما في ذلك بصمات الاقدام الموحدة والمكونات المعيارية ومبادئ التصميم المفتوح المصدر. التالي ، يمكن تصميم حلول للتطبيقات المتخصصة الجديدة دون إدخال تعديلات رئيسيه علي النظام. تتالف من وحدات عاليه ومفتوحة المصدر wetware ، والاجهزه ، والكترونيات ، والبرمجيات علي شبكه الإنترنت ، ايفولفير هو أول نظام الثقافة المستمر الألى التي يمكن ان تكون فعاله من حيث التكلفة وبسهوله أعاده تكوينها لتنفيذ اي نوع تقريبا من تجربه نمو عاليه الانتاجيه. من خلال الأكمام الذكية وحدات وبرمجه التي منزل جميع أجهزه الاستشعار والمحركات اللازمة للسيطرة علي الثقافات الفردية ، ايفولفير تمكن بشكل فريد من التوسع في كل من الانتاجيه والسيطرة الفردية للظروف الثقافية. وعلاوة علي ذلك ، وكمنصة علي شبكه الإنترنت ، تتبادل ايفولفير البيانات والمعلومات مع أجهزه الكمبيوتر البعيدة في الوقت الحقيقي ، مما يسمح بالرصد المتزامن لمئات الثقافات الفردية والاضطرابات الثقافية المؤتمتة من خلال السيطرة المحددة تعسفا خوارزميات.
في العمل السابق16, وقد تجلي أداء ايفولفير قويه في التجارب طويلة الأجل علي مدي مئات الساعات من العمل, وقدرته علي زراعه الكائنات الحية المختلفة, من e. كولاي و s. سيريفيسياي إلى غير المستانسه الميكروبات. وأجريت سلسله من التجارب المتميزة لاختيار النمو ، حيث طبقت تدرجات الاختيار المتعددة الابعاد المحددة برمجيا عبر مجموعه من الظروف الثقافية الفردية وكانت المناظر الطبيعية للياقة الخلوية الناتجة كميا. هنا ، والهدف هو تزويد المستخدمين ايفولفير مع وصفا لكيفيه استخدام النظام لتصميم وهذه الأنواع من التجارب. وكمثال توضيحي ، يتم تقديم طرق القياس الكمي للمشهد اللياقة البدنية من المسوخ s. سيريفيسياي عبر التدرج البيئي ثنائي الابعاد تتالف من درجه الحرارة والإجهاد الاسموزي. البروتوكول يرشد المستخدمين من خلال تكوين اطار ايفولفير لهذه التجربة علي حد سواء برمجيا ، في استخدام البرنامج لتعيين التعكر المخصصة وإجراءات التحكم في درجه الحرارة لكل من 16 الثقافات المستمرة موازيه ، وجسديا ، من خلال تخطيط فلويديكس لتوجيه الوسائط بشكل مناسب من تركيزات الملح المختلفة. وينبغي ان يكون هذا البروتوكول بمثابه قاعده عامه لتكوين ايفولفير لتنفيذ مجموعه واسعه من التجارب الثقافية المستمرة الألى للدراسات والتخصصات المتنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختيار النمو هو أداه لا غني عنها في علم الاحياء ، وتستخدم علي نطاق واسع لتوليد وتوصيف الاختلافات الظاهرية بين السكان الخلويين. وفي حين تسمح ثقافات الدفعات باختيار النمو بطريقه محدوده ، فان تقنيات الثقافة المستمرة توسع بشكل كبير من درجه التحكم والقابلية للتنبؤ بهذه التجارب ، من خلال ممارسه التنظيم الدقيق للشكل وديناميات الاختيار لتوليد النتائج الكمية القابلة للتكرار22. وقد استخدمت الثقافة المستمرة للسيطرة الصارمة علي اختيار المكتبات العالية التنوع20،23،24،25، وتنفيذ الانظمه التكيفيه المتطورة في التجريبية موجه تطور11,12,26,27. كما تمكن الثقافة المستمرة من التوصيف الدقيق للخلايا عبر مجموعه من الظروف المضبوطة كميا لتحسين فهم النظم الوراثية المعقدة وتحسين سلالات الإنتاج الحيوي المهندسة9و14 , 28–
ومع ذلك ، لا يوجد بروتوكول عالمي للثقافة المستمرة ، حيث ان التغييرات الدقيقة في الظروف الانتقائية يمكن ان تؤدي إلى تغييرات جذريه في النتائج البيولوجية4،29،30. ويجب ان تكون التجارب قادره علي الاختيار بين نظم الاختيار وتكييف البروتوكولات والمعدات التجريبية وفقا لذلك. بالاضافه إلى تقديم الاختيار بين معلمات التحكم ، مثل هذه الانظمه من الناحية المثالية ان تكون متطورة بما يكفي لأداره العديد من المعلمات بشكل مستقل في وقت واحد في التجارب المتوازية للغاية التي تحتاج إلى فك التفاعل المدخلات في معقده النظم البيولوجية (مثل الرسائل المعرفية). وتتصدي ايفولفير لهذا التحدي من خلال تمكين المستخدمين من التحكم التعسفي في التغذية المرتدة بين الظروف الثقافية والوظائف المميعة من أجل تحديد المنافذ البيئية المتخصصة للغاية.
للتغلب علي القيود في الاعداد الحالي وتوسيع أو تغيير معلمات التحكم ، يمكن بسهوله أعاده تصميم الأكمام الذكية لأضافه أجهزه استشعار جديده أو المحركات. الاضافه إلى ذلك ، فان خفض حجم القارورة سيقلل من النفقات الاعلاميه التي يمكن ان تكون كبيره في الثقافة المستمرة. وفي حين يسمح التصميم الحالي بقياس ومراقبه درجه الحرارة ، والانفعالات الثقافية ، والحث الخفيف ، والتعكر ، والمزامير ، يجب قياس البارامترات الأخرى خارجيا عن طريق أخذ العينات من القنينات. ويشمل العمل الحالي دمج القدرة علي مراقبه النشاط الانزيمي عن طريق لوسيفيراز وتنظيم الأكسجين المذاب والحموضة مباشره في الثقافات ايفولفير. بالاضافه إلى ذلك ، في حين لم تظهر في هذا العمل ، يمكن ايفولفير واجهه مع الاجهزه الجديدة الإرسال المضاعف ميليفلويدريك16 التي تعتمد علي مبادئ التكامل علي نطاق واسع (الناشئة من الكترونيات والتي اعتمدتها ميكروفلويديكس) من أجل بشكل غير مكلف تمكين معالجه فلويدريك أكثر تعقيدا (علي سبيل المثال المدخلات فلويدريك متعدد الإرسال ، والنقل من قارورة إلى قنينة). ويمكن تصميم هذه الوحدات المبللة وتصنيعها بالبالكامل في المختبر ، مما يسمح للمستخدمين بتوجيه السوائل عن طريق التفعيل البرمجي لتركيبات مختلفه من الصمامات في الروتين الألى للسوائل. وهذا يتيح للمستخدمين التغلب علي التصاميم المرنة التي تستخدم تقليديا في الثقافة المستمرة ، ولكن أيضا لقياس القدرات المميعة إلى الانتاجيه العالية مع عدد اقل من عناصر التحكم المكلفة (مثل المضخات التمعجيه). وأخيرا ، فاننا نامل في دمج منصة التشكيل التلقائي التي سوف تستخدم هذه المكونات ميليفلويديكس وDIY ، والتغلب علي الحد من التفاعل اليدوي خلال التجارب أطول وأكبر حيث الثقافات أخذ العينات ستكون مرهقه.
الاضافه إلى التعديلات المادية علي المنصة ، يفتح البرنامج القائم علي شبكه الإنترنت درجات جديده من الحرية من خلال السماح للمستخدمين بكتابه وتحرير ومشاركه البرامج النصية المخصصة للايفولفر ، والقيام بالبرمجة المؤتمتة بالبالكامل ، وتمكين التغذية المرتدة. يمكن للمستخدمين المسح برمجيا عبر نطاقات المعلمات في الاختلافات الدقيقة علي نفس نظام التحديد أو ربط خوارزميات التحكم في تركيبات جديده لتحديد اي عدد من مخططات الاختيار المتطورة. وعلاوة علي ذلك ، فان القدرة علي رصد الثقافات بسهوله في الوقت الحقيقي تحول الطريقة التي تجري بها التجارب. مع الرصد في الوقت الحقيقي ، يمكن للمستخدمين 1) التحقق من الاتساق بين أشواط ، ميزه حرجه للتطبيقات الإنتاج الحيوي والتجارب عاليه الانتاجيه ، و 2) التدخل اثناء التجارب إذا لزم الأمر ، لاستكشاف السلالات الصعبة التي تظهر ضعف النمو أو تكوين بيوفيلم ، أو تشخيص أخطاء المستخدم (علي سبيل المثال ، التلوث). وأخيرا ، مع جمع تدفقات البيانات المتعددة وتفسيرها في الوقت الحقيقي لكل ثقافة علي حده ، يولد ايفولفير كثافة عاليه من البيانات ، والتي قد تسهل نهج التعلم الألى للتحليل النهائي الرواية.
إلى جانب الاستخدامات الموضحة لتوصيف اللياقة البدنية ، واختيار المكتبة ، وتطور المختبرات ، فاننا نري عددا من المجالات ذات الصلة جاهزه للتنفيذ في ايفولفر مع فلويديكس متكاملة. تجارب ايفولفير مع عينات الميكروبيوم يمكن ان مقايسة استقرار المجتمع في بيئات تسيطر31,32, استكشاف تكوين الكائنات المجهرية باستخدام تقنيات الثقافات33, أو خلط الأنواع بشكل حيوي استجواب الديناميات الايكولوجيه للاستعمار أو الغزو34،35. ويمكن بسهوله تنفيذ العديد من الطرق للتطور الموجه المستمر من الجزيئات الحيوية علي الجهاز وكذلك26,36,37, زيادة كبيره في امكانيه الوصول والانتاجيه لهذه النظم. القدرة علي تحسين ظروف النمو مثل تكوين وسائل الاعلام ، ودرجه الحرارة ، والسلالات في ديناميكية ، ويمكن ان تساعد في طبيعة الانتاجيه العالية في الجهود الأمثل للتطبيقات الحيوية الصناعية9. ونحن نتصور أيضا دمج عموديا ايفولفير مع تقنيات التحليل الأخرى مثل المجهر والتدفق الخلوي في حلقه مغلقه الأزياء ، وتوفير نظام مؤتمتة بالبالكامل للنمو وتحليل الثقافات الخلوية في كل خليه واحده والسكان مستويات. وعلاوة علي ذلك ، مع بعض التعديلات الاجهزه علي الأكمام الذكية مثل ختم السفينة والسيطرة علي محتوي الغاز ، ويمكن تكييفها ايفولفير لدعم نمو مجموعه أوسع من أنواع الخلايا ، مثل تعليق خلايا الثدييات. ومن الممكن أيضا وضع الإطار بأكمله في غرفه لاهوائية لثقافة الخلايا لاهوائية. نتطلع إلى الامام ، ونحن نهدف إلى بناء اطار البرمجيات لدينا في البنية التحتية سحابه مركزيه ونعتقد ان هذا من شانه ان يسمح للمستخدمين بسهوله تكوين وتحليل وتبادل البيانات الخاصة بهم عن بعد دون الحاجة إلى ان تكون موجودة جسديا في المختبر. ومن شان البنية التحتية للسحابة ، التي تعمل كامينه للبيانات ، ان تصلح أيضا للتحليلات الفوقية الواسعة النطاق عبر التجارب. ونتوقع ان توسع ايفولفر وهذه التطورات المستقبلية إلى حد كبير نطاق التجارب المحتملة لاختيار النمو من خلال تسهيل الاتمته والابتكار في الثقافة المستمرة.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ب. ستافورد لمساعدته في تصميم النظام ، و h. خليل ، ا. سولتانيانزاده ، ا. صن ، s. الأنابيب ، و ا. كافالي للمساعدة في بناء النظام. ونحن نعترف بمرفق تصميم الكترونيات ، ومركز الابتكار المنتجات الهندسية (EPIC) ، والبرمجيات & تطبيقات مختبر الابتكار (الشراع) في معهد الحريري للحوسبة في جامعه بوسطن لخدماتهم. وكان هذا العمل مدعوما بجائزه NSF المهنية (MCB-1350949 إلى A.S.K.) ، ومنح داربا HR0011-15-0091 و HR0011-2-0014 (إلى A.S.K.). وتعترف A.S.K. أيضا بالتمويل من جائزه المبتكر الجديد لمدير المعاهد القومية للصحة (1DP2AI131083-01) ، وجائزه كليه داربا الشبابية (D16AP00142) ، وحملات NSF في الحوسبة (CCF-1522074).
Materials
| 5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
| a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
| Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
| Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
| CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
| Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
| Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
| eVOLVER Unit | FynchBio | ||
| Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
| Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
| Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
| High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
| Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
| SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
| Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |
Referenzen
- Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
- Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
- Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
- Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
- Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetik. 200 (2), 619-631 (2015).
- Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
- Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetik. 206 (2), 1153-1167 (2017).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
- Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance – WOSP ’00. , 195-203 (2000).
- Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).
- Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).
- Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
- Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
- Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
- Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
- McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536 (2018).
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).
- Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).
- Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
- Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42 (2015).
- Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
- Lagier, J. -. C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
- Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
- Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
- Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051 (2016).
- Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).
